High-level expression of a truncated 1,3-1,4-β-D-glucanase from Fibrobacter succinogenes in Pichia pastoris by optimization of codons and fermentation
- 作者
- Huoqing Huang, Peilong Yang, Huiying Luo, Huigui Tang, Na Shao, Tiezheng Yuan, Yaru Wang, Yingguo Bai, Bin Yao
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2008）
- DOI
- 10.1007/s00253-007-1290-4
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
实现Fibrobacter succinogenes截短1,3-1,4-β-D-葡聚糖酶在毕赤酵母中的高水平分泌表达，克服野生型基因表达量低的问题。
研究策略
对α-因子信号肽和截短葡聚糖酶基因进行整体密码子优化，调整G+C含量、消除AT富集区域、优化mRNA二级结构与AUG起始密码子周边结构，并开发分阶段补料（甘油/甲醇混合补料后切换纯甲醇）的高密度发酵策略。
核心内容
针对Fibrobacter succinogenes来源的截短1,3-1,4-β-D-葡聚糖酶在毕赤酵母中表达量低的问题，该研究将α-因子信号肽与结构基因作为整体进行密码子优化，调整G+C含量、消除AT富集区并优化mRNA二级结构和AUG起始密码子周边序列，共改变189个核苷酸。优化后的mRNA二级结构使产量提高2倍。在此基础上开发了两阶段补料发酵策略，先以5%甘油与95%甲醇混合补料3天，再切换至纯甲醇继续诱导3天，最终酶活达到15,249±441 U/ml，较单纯甲醇和单纯混合补料分别提高38.5%和16.5%。重组葡聚糖酶产量最高达3 g/l，约占总分泌蛋白的90%。纯化酶比活为5,180±133 U/mg，90°C处理30分钟后残留活性超过78%。该研究通过密码子优化与发酵策略的协同优化，实现了该酶在毕赤酵母中的高水平分泌表达，为工业应用提供了可行方案。
创新点
将信号肽和结构基因作为整体进行密码子优化；同时考虑mRNA二级结构和AUG起始密码子上下文；提出两阶段补料诱导发酵策略（先5%甘油+95%甲醇混合补料3天，后100%甲醇3天）。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris GS115 | 1,3-1,4-β-葡聚糖水解 | bgl-m | 1,3-1,4-β-D-葡聚糖酶 (r-Bgl) | 催化 | 截短酶，密码子优化后G+C含量48.8%，产量3 g/l，比活5180 U/mg |
| Pichia pastoris GS115 | 蛋白分泌途径 | α-factor (MFα1) | α-factor prepro-leader | 转运 | 信号肽，密码子优化后G+C含量48.3%，使产量较野生型信号肽提高约2倍 |
| Pichia pastoris GS115 | 甲醇代谢 | AOX1 | 醇氧化酶启动子 | 调控 | 甲醇诱导启动子，用于驱动bgl-m表达 |
关键发现
- 密码子优化共改变189个核苷酸，信号肽和葡聚糖酶G+C含量分别调整为48.3%和48.8%
- 优化mRNA二级结构使产量提高2倍
- 采用两阶段补料策略后，酶活达15,249±441 U/ml，比单纯甲醇和单纯混合补料分别提高38.5%和16.5%
- 重组葡聚糖酶产量最高达3 g/l，约占总分泌蛋白的90%
- 纯化酶比活为5,180±133 U/mg，Km为2.55 mg/ml，kcat为2,218±116 s-1
- 90°C处理30min后残留活性>78%。
研究结论
通过综合密码子优化和两阶段补料策略，实现了Fibrobacter succinogenes截短1,3-1,4-β-D-葡聚糖酶在毕赤酵母中的最高水平分泌表达（3 g/l），该策略具有工业应用潜力。