Overexpression of the gene encoding HMG-CoA reductase in Saccharomyces cerevisiae for production of prenyl alcohols
- 作者
- Chikara Ohto, Masayoshi Muramatsu, Shusei Obata, Eiji Sakuradani, Sakayu Shimizu
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2008）
- DOI
- 10.1007/s00253-008-1807-5
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
开发微生物发酵法生产(全E)-型异戊烯醇（FOH、NOH、GGOH），避免化学合成产生异构体混合物，并实现高效生产。
研究策略
在酿酒酵母中过表达甲羟戊酸途径和异戊二烯焦磷酸途径的酶基因，系统评估各基因对异戊烯醇产量的影响；筛选最适宿主菌株和启动子；构建截短跨膜域的HMG1突变体；通过5 L发酵罐培养优化产物产量。
核心内容
该研究在酿酒酵母中系统评估了甲羟戊酸途径与异戊二烯焦磷酸途径多个酶基因过表达对异戊烯醇（FOH、NOH、GGOH）产量的影响，发现过表达HMG-CoA还原酶基因HMG1是提升产量的最有效策略。通过宿主筛选，携带AUR1-C突变的衍生株AURGG101被鉴定为最佳生产菌株，其HMG1过表达使FOH产量达35.6 mg/L，约为原始宿主ATCC 200589的4倍。进一步采用GAL1启动子和截短跨膜域的HMG1突变体pYHMG044，在5 L发酵罐中无pH控制时FOH、NOH、GGOH产量分别达122.7、98.8和2.46 mg/L；当pH维持7时FOH产量进一步提高至145.7 mg/L，但NOH产量显著下降至0.87 mg/L。该研究验证了通过优化宿主、启动子和HMG1截短策略实现微生物发酵法高效生产(全E)-型异戊烯醇的可行性，为替代化学合成路线提供了基础。
创新点
['发现过表达HMG-CoA还原酶基因（HMG1）是提高异戊烯醇产量的最有效策略', '筛选出ATCC 200589及其衍生株AURGG101（含AUR1-C突变）作为最佳生产宿主', '发现AUR1-C突变可能通过改变脂质组成促进异戊烯醇积累', '构建去除部分跨膜域（1192-1266 bp）的HMG1突变体pYHMG044，进一步提升FOH产量']
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae ATCC 200589 | 甲羟戊酸途径 | HMG1 | HMG-CoA还原酶 | 催化 | 过表达最有效的基因，在GAL1启动子下FOH产量72.7 mg/L |
| Saccharomyces cerevisiae AURGG101 | 甲羟戊酸途径 | HMG1 (截短体pYHMG044) | HMG-CoA还原酶（截短跨膜域） | 催化 | 5 L发酵罐无pH控制时FOH 122.7、NOH 98.8、GGOH 2.46 mg/L；pH控制时FOH 145.7 mg/L |
| Saccharomyces cerevisiae ATCC 200589 | 异戊二烯焦磷酸途径 | ERG20 | 法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | 过表达可提高GGOH产量 |
| Saccharomyces cerevisiae ATCC 200589 | 甲羟戊酸途径 | HMGS | HMG-CoA合酶 | 催化 | 过表达测试中效果不如HMG1 |
| Saccharomyces cerevisiae ATCC 200589 | 甲羟戊酸途径 | ERG12 | 甲羟戊酸激酶 | 催化 | 过表达测试中效果不如HMG1 |
| Saccharomyces cerevisiae ATCC 200589 | 甲羟戊酸途径 | ERG8 | 磷酸甲羟戊酸激酶 | 催化 | 过表达测试中效果不如HMG1 |
| Saccharomyces cerevisiae ATCC 200589 | 甲羟戊酸途径 | ERG19 | 甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶 | 催化 | 过表达测试中效果不如HMG1 |
| Saccharomyces cerevisiae ATCC 200589 | 异戊二烯焦磷酸途径 | IDI1 | 异戊烯基焦磷酸异构酶 | 催化 | 过表达测试中效果不如HMG1 |
| Saccharomyces cerevisiae ATCC 200589 | 异戊二烯焦磷酸途径 | BTS1 | 香叶基香叶基焦磷酸合酶 | 催化 | 过表达测试中效果不如HMG1 |
| Saccharomyces cerevisiae ATCC 200589 | 甲羟戊酸途径 | ERG10 | 乙酰辅酶A酰基转移酶 | 催化 | 过表达测试中效果不如HMG1 |
| Saccharomyces cerevisiae ATCC 200589 | 异戊二烯焦磷酸途径 | ispA (E. coli) | 法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | 来自大肠杆菌，在酵母中表达测试 |
| Saccharomyces cerevisiae ATCC 200589 | 异戊二烯焦磷酸途径 | idi (E. coli) | 异戊烯基焦磷酸异构酶 | 催化 | 来自大肠杆菌，在酵母中表达测试 |
关键发现
['过表达HMG1在ATCC 200589中使FOH、NOH、GGOH产量分别达到8.2、0.15、0.25 mg/L', '在AURGG101中过表达HMG1使FOH产量达35.6 mg/L，约为ATCC 200589的4倍', '使用GAL1启动子在ATCC 200589中过表达HMG1时，FOH、NOH、GGOH产量分别达到72.7、36.8、0.84 mg/L', '宿主筛选中ATCC 96029和ATCC 201741的HMG1过表达菌株分别产生9.5和10 mg/L角鲨烯，但几乎不产异戊烯醇', 'pYHMG044/AURGG101在5 L发酵罐无pH控制时，FOH、NOH、GGOH产量分别达到122.7、98.8、2.46 mg/L', 'pH维持7时，FOH产量进一步提高至145.7 mg/L，但NOH降至0.87 mg/L，GGOH为1.79 mg/L', '截短HMG1的pYHMG044在AURGG101中使FOH产量从8.0（pYES-HMG1）提高至8.6 mg/L']
研究结论
通过过表达HMG-CoA还原酶基因并结合最佳宿主（AURGG101）、启动子（GAL1）及截短型HMG1（pYHMG044），实现了酿酒酵母高效生产异戊烯醇，其中FOH最高产量达到145.7 mg/L，验证了发酵法生产(全E)-异戊烯醇的可行性。