NADH- vs NADPH-coupled reduction of 5-hydroxymethyl furfural (HMF) and its implications on product distribution in Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- João R. M. Almeida, Anja Röder, Tobias Modig, Boaz Laadan, Gunnar Lidén, Marie-F. Gorwa-Grauslund
- 单位
- 瑞典隆德大学应用微生物学系; 瑞典隆德大学化学工程系; 德国汉堡大学医学中心医学微生物学、病毒学与卫生学研究所
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2008）
- DOI
- 10.1007/s00253-008-1364-y
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在厌氧条件下，5-羟甲基糠醛（HMF）的还原分别由NADH和NADPH依赖的酶催化，不同辅因子偏好是否影响酿酒酵母的产物分布和发酵性能尚不清楚。
研究策略
构建过表达NADH依赖的突变型ADH1（mut-ADH1）和NADPH依赖的ADH6的酿酒酵母菌株，与空载体对照菌株一起，在合成培养基（含/不含HMF）和云杉水解液中进行厌氧分批发酵，比较生长、乙醇生产率、HMF转化速率及副产物（甘油、乙酸）产量。
核心内容
本研究构建了过表达NADH依赖的突变型ADH1（mut-ADH1）和NADPH依赖的ADH6的酿酒酵母菌株，在合成培养基及云杉水解液中厌氧发酵，系统比较辅因子偏好对HMF还原、产物分布和发酵性能的影响。在含2 g/L HMF的合成培养基中，ADH6菌株比生长速率最高（0.20 h⁻¹），mut-ADH1菌株为0.17 h⁻¹，对照仅为0.11 h⁻¹；特定乙醇生产率分别为0.61、0.53和0.34 g·g⁻¹·h⁻¹，HMF摄取率也相应提高至0.90、0.83和0.30 g·g⁻¹·h⁻¹。无HMF时三菌株生长和乙醇产量无差异。副产物方面，mut-ADH1菌株在HMF转化期乙酸盐产量较无HMF时提高10倍，ADH6菌株甘油产量提高24%。在云杉水解液中，两种过表达菌株的HMF转化率约为对照的4-5倍，初始乙醇生产率也显著提升。结果表明，增强HMF还原活性可有效缓解抑制剂毒性并提高乙醇生产率，辅因子选择会改变副产物分布，但该效应在水解液中不显著。
创新点
首次在厌氧条件下比较NADH偶联和NADPH偶联的HMF还原对酿酒酵母产物分布的影响；证明辅因子选择会改变副产物（尤其是乙酸）的生成，且提高HMF还原活性可显著提升特定乙醇生产率。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D | HMF还原 | ADH6 | Adh6p | 催化 | NADPH依赖的HMF还原酶，过表达菌株TMB3286 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D | HMF还原 | mut-ADH1 | mut-Adh1p | 催化 | NADH依赖的突变型乙醇脱氢酶1，过表达菌株TMB3206 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D | 葡萄糖发酵 | — | — | 催化 | 对照菌株TMB3280，携带空质粒YEplacHXT |
关键发现
- 在含2 g/L HMF的合成培养基中，ADH6菌株比生长速率最高（0.20 h^-1），mut-ADH1菌株为0.17 h^-1，对照为0.11 h^-1
- 特定乙醇生产率分别为0.61、0.53、0.34 g·g^-1·h^-1
- HMF摄取率分别为0.90、0.83、0.30 g·g^-1·h^-1。无HMF时三菌株比生长速率均为0.29 h^-1，最终乙醇产量均为0.43 g/g葡萄糖。副产物方面，mut-ADH1菌株在HMF转化期乙酸盐产量比无HMF时高10倍
- ADH6菌株最终甘油产量比无HMF时高24%
- 最终乙酸盐产量三菌株均比无HMF时高2倍。在云杉水解液中，mut-ADH1和ADH6菌株的HMF转化率分别为0.052和0.049 g·g^-1·h^-1，是对照（0.012 g·g^-1·h^-1）的4-5倍
- 初始特定乙醇生产率分别为0.39和0.40 g·g^-1·h^-1，高于对照的0.32 g·g^-1·h^-1。
研究结论
通过过表达mut-ADH1或ADH6增强HMF体内还原活性，可显著提高酿酒酵母在HMF存在下的特定乙醇生产率，且不影响最终乙醇产量；辅因子的使用（NADH vs NADPH）会改变产物分布（如乙酸盐和甘油的产量），但在云杉水解液中副产物变化不明显。