Isolation and characterization of a stress-inducible Dunaliella salina Lcy-β gene encoding a functional lycopene β-cyclase
- 作者
- Ana Ramos, Sacha Coesel, Ana Marques, Marta Rodrigues, Alexandra Baumgartner, João Noronha, Amélia Rauter, Bertram Brenig, João Varela
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2008）
- DOI
- 10.1007/s00253-008-1492-4
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
Dunaliella salina在胁迫条件下积累大量β-胡萝卜素，但其类胡萝卜素生物合成相关基因的分子基础和调控机制尚不清楚。
研究策略
通过RACE PCR克隆D. salina的Lcy-β全长cDNA及基因组序列，利用生物信息学分析基因结构，通过Northern blot分析不同非生物胁迫（高盐、高光、缺氮）下的转录水平，并在大肠杆菌中进行异源功能互补验证。
核心内容
该研究从杜氏盐藻中克隆并鉴定了编码番茄红素β-环化酶的Lcy-β基因。通过RACE PCR获得全长cDNA，长度为1910 bp，开放阅读框编码584个氨基酸，预测分子量为64.5 kDa；基因组序列约9 kb，包含11个外显子和10个内含子。序列比对显示DsLcy-β与雨生红球藻和莱茵衣藻的Lcy-β氨基酸相似性分别为67%和64%。在大肠杆菌中的异源功能互补实验证实该基因编码的蛋白可将番茄红素转化为β-胡萝卜素。Northern blot分析表明，高盐、高光和缺氮胁迫均能诱导DsLcy-β转录水平升高，其中盐与缺氮联合处理下转录水平最高；β-胡萝卜素积累在缺氮条件下显著增加，高光联合缺氮处理下，高光组每细胞β-胡萝卜素积累约为低光组的2倍。研究首次报道了该基因的完整基因组结构，证明营养缺乏是调控类胡萝卜素合成和基因表达的关键因子，转录调控是杜氏盐藻类胡萝卜素积累的重要机制，该基因为代谢工程改造类胡萝卜素生产提供了潜在靶点。
创新点
首次报道D. salina Lcy-β基因的完整基因组结构（11个外显子和10个内含子）；证明该基因受高盐、高光和营养缺乏的诱导，且营养缺乏是类胡萝卜素积累和基因表达的关键调控因子。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Dunaliella salina | 类胡萝卜素生物合成 | Lcy-β (DsLcy-β) | lycopene β-cyclase | 催化 | 从D. salina中克隆，催化番茄红素环化为β-胡萝卜素，受高盐、高光、缺氮胁迫诱导 |
| Escherichia coli TOP10 | 异源类胡萝卜素合成 | DsLcy-β | lycopene β-cyclase | 催化 | 通过pQE-80L载体异源表达，与pAC-LYC共转化使大肠杆菌积累β-胡萝卜素 |
| Dunaliella salina | 类胡萝卜素生物合成 | Psy | phytoene synthase | 催化 | 先前研究表明其受营养缺乏调控，本文作为相关基因提及 |
| Dunaliella salina | 类胡萝卜素生物合成 | Pds | phytoene desaturase | 催化 | 先前研究表明其受营养缺乏调控，本文作为相关基因提及 |
关键发现
- 分离得到D. salina Lcy-β全长cDNA，长1910 bp，开放阅读框84-1835 bp，编码584个氨基酸，预测分子量64.5 kDa
- 基因组序列约9 kb，包含11个外显子和10个内含子，外显子约占21%（1.9 kb/9 kb）。DsLcy-β与H. pluvialis和C. reinhardtii的Lcy-β氨基酸序列相似性分别为67%和64%。异源表达表明该基因编码的蛋白可将番茄红素转化为β-胡萝卜素。转录分析显示，在36 h时，高盐（18%+N）、缺氮（9%-N）及盐+缺氮（18%-N）均使DsLcy-β mRNA水平较对照（9%+N）升高，其中盐+缺氮处理下转录水平最高。β-胡萝卜素积累在缺氮条件下显著增加，高盐+缺氮处理下每细胞β-胡萝卜素含量最高
- 高光+缺氮处理下，高光组（500 μmol m⁻² s⁻¹）在48 h时的每细胞β-胡萝卜素积累约为低光组（45 μmol m⁻² s⁻¹）的2倍。
研究结论
D. salina的Lcy-β基因受非生物胁迫的转录诱导，营养缺乏是调控类胡萝卜素合成和基因表达的关键因素；转录调控是D. salina类胡萝卜素积累的重要机制，该基因可用于代谢工程改造。