C1 compounds as auxiliary substrate for engineered Pseudomonas putida S12
- 作者
- Frank W. Koopman, Johannes H. de Winde, Harald J. Ruijsenaars
- 单位
- B-Basic, Delft, The Netherlands; Kluyver Centre for Genomics of Industrial Fermentation, Delft, The Netherlands; TNO-Quality of Life, Business Unit Food and Biotechnology Innovations, Delft, The Netherlands; Department of Biotechnology, Delft University of Technology, Delft, The Netherlands
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2009）
- DOI
- 10.1007/s00253-009-1922-y
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在基于Pseudomonas putida S12的生物转化过程中，糖底物大量用于生成能量和还原力而非生物量和产物，导致成本高；论文旨在通过引入C1化合物（甲醛/甲醇）作为廉价辅助底物，提高生物量产率并改善过程经济性。
研究策略
将Bacillus brevis的RuMP途径关键酶基因hps和phi导入P. putida S12，构建甲醛代谢途径；在碳限制恒化培养中，以葡萄糖为主底物、甲醛或甲醇为辅助底物，通过逐步改变碳源比例测定生物量产率。
核心内容
该研究在恶臭假单胞菌S12中异源表达了来自短短芽孢杆菌的核酮糖单磷酸途径关键酶3-己酮糖-6-磷酸合酶和6-磷酸-3-己酮糖异构酶，构建了甲醛同化途径，并考察了以葡萄糖为主底物、甲醛或甲醇为辅助底物时的生物量产率。在碳限制恒化培养中，未添加甲醛时葡萄糖生物量产率为35%，而当相对甲醛浓度达到60%时，工程菌产率提高至91%；以甲醇替代甲醛时产率达到84%。研究发现该菌株具有内源甲醇氧化活性（145 U/g蛋白，约为甲醛活性的1/50），且工程菌的Hps/Phi组合活性达6800 U/g蛋白。在稀释率0.2 h⁻¹下两类菌均能利用50%相对甲醛，但60%时均被洗出；在0.03 h⁻¹下对照菌无法利用60%甲醛而洗出，工程菌则达到稳态。RuMP途径菌株的产率增益约为对照菌的两倍，提示甲醛共同化作用使按葡萄糖计的产率被高估。结果表明引入RuMP途径能显著提升C1化合物辅助利用效率，甲醇因毒性低、廉价可再生而更具应用前景，为改善生物转化过程经济性提供了可行策略。
创新点
首次在P. putida S12中异源表达RuMP途径的Hps和Phi，实现甲醛和甲醇作为辅助底物的高效共利用；发现P. putida S12具有内源甲醇氧化活性（可能为广谱醇脱氢酶的副活性）；证明引入RuMP途径可使产率提升约两倍于内源线性氧化途径。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pseudomonas putida S12 | 核酮糖单磷酸途径 (RuMP) | hps | 3-己酮糖-6-磷酸合酶 (Hps) | 催化 | 来自Bacillus brevis S1，催化甲醛与核酮糖-5-磷酸缩合为6-己酮糖-6-磷酸，异源表达于P. putida S12 |
| Pseudomonas putida S12 | 核酮糖单磷酸途径 (RuMP) | phi | 6-磷酸-3-己酮糖异构酶 (Phi) | 催化 | 来自Bacillus brevis S1，催化6-己酮糖-6-磷酸异构化为果糖-6-磷酸，与Hps共同构成RuMP途径前两步 |
| Pseudomonas putida S12 | 甲醛氧化途径（线性氧化） | — | 甲醛脱氢酶 (内源) | 催化 | 内源酶活性，将甲醛氧化为甲酸，是P. putida S12固有的甲醛脱毒途径 |
| Pseudomonas putida S12 | 甲醛氧化途径（线性氧化） | — | 甲酸脱氢酶 (内源) | 催化 | 内源酶活性，将甲酸氧化为CO2，与甲醛脱氢酶共同完成甲醛的线性氧化 |
| Pseudomonas putida S12 | 甲醇氧化 | — | 甲醇脱氢酶活性 (内源) | 催化 | 可能为广谱醇脱氢酶的副活性，活性为145 U/g蛋白，能将甲醇氧化为甲醛，但活性较低 |
关键发现
- 在不添加甲醛时，葡萄糖为碳源的生物量产率为35% (C-mol biomass/C-mol glucose)
- 添加60%相对甲醛浓度时，RuMP途径工程菌产率提高至91%
- 以甲醇替代甲醛，产率达到84%
- Hps/Phi组合活性达6800 U/g蛋白，甲醇氧化活性为145 U/g蛋白（约为甲醛活性的1/50）
- 在D=0.2 h⁻¹时，工程菌和对照菌均可利用50%相对甲醛浓度，但60%时均洗出
- 在D=0.03 h⁻¹时，对照菌无法利用60%甲醛而洗出，工程菌达到稳态并实现91%产率
- 甲醇实验中约25%的甲醇未被代谢，但无甲醛或甲酸积累
- RuMP途径菌株的产率增益约为对照菌的两倍，提示甲醛共同化作用导致按葡萄糖计的产率被高估。
研究结论
通过在P. putida S12中表达RuMP途径的Hps和Phi，成功实现了C1化合物（甲醛和甲醇）作为辅助底物的共利用，显著提高了生物量产率。甲醇由于毒性低、廉价且可再生，是更优选的辅助底物。本研究为提升生物转化过程的原料利用效率和经济性提供了有效策略。