高级醇 · 代谢工程文献库

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Elimination of by-product formation during production of 1,3-propanediol in Klebsiella pneumoniae by inactivation of glycerol oxidative pathway

作者
Mi-Young Seo, Jeong-Woo Seo, Sun-Yeon Heo, Jin-Oh Baek, Dina Rairakhwada, Baek-Rock Oh, Pil-Soo Seo, Min Ho Choi, Chul Ho Kim
单位
Molecular Bioprocess Research Center, Jeonbuk Branch Institute, KRIBB, Jeongeup, Jeonbuk 580-185, South Korea; School of Life Sciences and Biotechnology, Korea University, Seoul 136-701, South Korea; School of Biological Sciences and Technology, Chonnam National University, Gwangju 500-757, South Korea
杂志
Applied Microbiology and Biotechnology（2009）
DOI
10.1007/s00253-009-1980-1
所属领域
代谢工程
关键词
1,3-PropanediolBy-productGlycerol metabolismKlebsiella pneumoniae
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解决的核心问题

消除肺炎克雷伯氏菌发酵生产1,3-丙二醇过程中副产物（乙醇、乳酸、琥珀酸、2,3-丁二醇等）的形成，特别是沸点相近、难分离的2,3-丁二醇。

研究策略

敲除甘油氧化途径的关键基因（dhaD-dhaK或转录因子dhaR），并同时删除dhaT；用IPTG诱导的lacZ启动子替换dhaB天然启动子；再通过质粒引入dhaT和orfWX恢复还原途径。

研究路线图

100%
研究问题：消除副产物 2,3-丁二醇等
策略：敲除甘油氧化途径 dhaD-dhaK / dhaR
关键改造 1：敲除 dhaT
关键改造 2：lacZ 启动子替换 dhaB
关键改造 3：质粒引入 dhaT+orfWX
结果：副产物完全消除；产量略降
结论：氧化途径灭活构建工业潜力菌株
深入分析：DhaR 调控验证与代谢瓶颈
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核心内容

该研究通过代谢工程改造肺炎克雷伯氏菌，旨在消除1,3-丙二醇发酵过程中副产物（尤其是难分离的2,3-丁二醇）的形成。研究者敲除了甘油氧化途径关键基因dhaD-dhaK或转录因子dhaR，同时删除还原途径的dhaT，并用IPTG诱导的lacZ启动子替换dhaB天然启动子，再通过质粒引入dhaT和orfWX以恢复还原途径。结果显示，突变株AK和AR成功实现除乙酸盐外所有副产物（乙醇、乳酸、琥珀酸、2,3-丁二醇）的完全消除。然而，突变株仅利用30%的甘油，1,3-丙二醇产量仅为亲本的18.4%；引入互补质粒后，AK菌株产量为5.2 g/L，低于亲本的7.7 g/L，但产率达0.57 mol/mol，高于亲本的0.47 mol/mol。DhaB酶活分别降低46%和60%。该研究首次证明DhaR在dha调节子中的直接调控作用，构建的平台菌株虽产量略降，但副产物完全消除且产率提升，具备工业应用潜力，后续需解决启动子替换导致的活性降低及NADH供应不平衡问题。

创新点

首次证明DhaR在肺炎克雷伯氏菌dha调节子中直接调控作用；通过破坏氧化途径实现了除乙酸盐外副产物的完全消除；构建的平台菌株具有工业应用潜力。

研究对象（6）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Klebsiella pneumoniae Cu 甘油氧化途径 dhaD DhaD 催化 NAD+依赖性甘油脱氢酶，氧化途径第一步，突变株中敲除
Klebsiella pneumoniae Cu 甘油氧化途径 dhaK DhaK 催化 ATP依赖性二羟丙酮激酶，与dhaD同被敲除
Klebsiella pneumoniae Cu 甘油代谢dha调节子 dhaR DhaR 调控 推定转录因子，激活dha调节子基因表达，突变株AR中敲除
Klebsiella pneumoniae Cu 甘油还原途径 dhaT DhaT 催化 NADH依赖性1,3-丙二醇氧化还原酶，在突变株中敲除后由质粒恢复
Klebsiella pneumoniae Cu 甘油还原途径 dhaB DhaB 催化 辅酶B12依赖性甘油脱水酶，其天然启动子被lacZ启动子替换，活性降低
Klebsiella pneumoniae Cu 甘油还原途径 orfWX OrfW 调控 DhaB再激活因子，通过质粒过表达可部分恢复DhaB活性

关键发现

  1. 突变株AK和AR在甘油培养基中仅利用30%的甘油，而亲本Cu利用100%
  2. 突变株中1,3-丙二醇产量仅为亲本的18.4%
  3. 引入pBR-dhaT-orfWX后，AK/AR菌株产1,3-PD为5.2 g/L，低于Cu菌株的7.7 g/L，但AK菌株的产率为0.57 mol/mol，高于Cu菌株的0.47 mol/mol
  4. AK和AR菌株的DhaB酶活分别降低46%和60%
  5. 除乙酸盐外所有副产物（乙醇、乳酸、琥珀酸、2,3-丁二醇）均未检出。

研究结论

通过灭活甘油氧化途径（敲除dhaD/dhaK或dhaR）并删除dhaT，成功构建了不产生副产物的1,3-PD生产菌株，但产量略低于亲本，其原因可能与DhaB启动子替换导致活性降低及NADH供应不平衡有关，需进一步改造。