Geranylgeranyl diphosphate synthase genes in entomopathogenic fungi
- 作者
- Suthitar Singkaravanit, Hiroshi Kinoshita, Fumio Ihara, Takuya Nihira
- 单位
- International Center for Biotechnology, Osaka University; Apple Pest Control Research Subteam, National Institute of Fruit Tree Science; MU-OU Collaborative Research Center for Bioscience and Biotechnology, Faculty of Science, Mahidol University
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2009）
- DOI
- 10.1007/s00253-009-2171-9
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
昆虫病原真菌中香叶基香叶基二磷酸（GGPP）合酶基因未被克隆和功能验证，限制了利用该类真菌生产萜类活性化合物。
研究策略
基于真菌GGPP合酶保守序列设计简并引物，通过PCR从5种代表性昆虫病原真菌中扩增同源基因；通过RACE获得M. anisopliae全长ggs1 cDNA；构建pET32a/ggs1载体在大肠杆菌中异源表达，并测定重组蛋白的GGPP合酶活性。
核心内容
本研究首次从昆虫病原真菌中克隆并功能鉴定了香叶基香叶基二磷酸（GGPP）合酶基因。作者基于真菌GGPP合酶保守序列设计简并引物，从5种代表性昆虫病原真菌中扩增出同源基因，其中绿僵菌和白僵菌均含有ggs1和ggs2两种类型。通过RACE技术获得绿僵菌ggs1全长cDNA，该基因长1080 bp，无内含子，编码359个氨基酸，其序列在17种昆虫病原真菌中高度保守（相似性93–98%），与已知真菌GGPP合酶同源性为67–81%。将ggs1构建至pET32a载体在大肠杆菌中异源表达，获得约55 kDa的重组蛋白，其比活性达337.94 nmol/mg protein/min，主要产物为GGPP，另有约11%的次要产物可能为六聚异戊二烯醇。表达分析显示ggs1在培养2、4、6天均组成型转录，而ggs2未检测到转录，提示二者功能分化。序列比对发现Ggs1含有两个天冬氨酸富集DDXXD基序及独特的丝氨酸富集区。该研究为昆虫病原真菌萜类生物合成机制提供了基础，并可为高产萜类菌株开发提供基因资源。
创新点
首次从昆虫病原真菌中克隆并功能鉴定GGPP合酶基因；发现ggs1编码的GGPP合酶具有独特的丝氨酸富集区（SSXSVSGSSS）；揭示ggs1组成型表达可能参与初级代谢，而ggs2可能参与次级代谢且仅在部分菌株中存在。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Metarhizium anisopliae NAFF635007 | 萜类生物合成途径 | ggs1 | GGPP合酶 (Ggs1) | 催化 | 编码组成型表达的GGPP合酶，包含独特的丝氨酸富集区，异源表达后具有GGPP合酶活性 |
| Metarhizium anisopliae NAFF635007 | 萜类生物合成途径 | ggs2 | GGPP合酶同源蛋白 (Ggs2) | 催化 | 仅在部分菌株中发现，与ggs1序列相似性较低，在实验条件下未检测到转录，推测与次级代谢相关 |
| Beauveria bassiana NAFF635036 | 萜类生物合成途径 | ggs1 | GGPP合酶 (Ggs1) | 催化 | 与M. anisopliae的ggs1高度同源，组成型表达 |
| Beauveria bassiana NAFF635036 | 萜类生物合成途径 | ggs2 | GGPP合酶同源蛋白 (Ggs2) | 催化 | 仅在部分菌株中发现，推测参与次级代谢 |
| Escherichia coli BL21(DE3)/pLysS | 重组蛋白表达系统 | ggs1（来自M. anisopliae） | Ggs1-His-tag重组蛋白 | 催化 | 作为异源表达宿主，用于GGPP合酶活性测定 |
关键发现
- 从5种昆虫病原真菌中扩增出GGPP合酶同源物，其中M. anisopliae和B. bassiana含有至少两种类型（ggs1和ggs2）
- ggs1在17种昆虫病原真菌中高度保守，氨基酸序列相似性达93-98%，与已知真菌GGPP合酶有67-81%同源性
- ggs1编码359个氨基酸（1080 bp，无内含子），异源表达产物约55 kDa（含His标签），其比活性为337.94 nmol/mg protein/min，主要产物为GGPP，次要产物（约为GGPP的11%）可能为六聚异戊二烯醇
- ggs1在培养2、4、6天均组成型转录，ggs2未检测到转录
- 序列比对显示ggs1含两个天冬氨酸富集DDXXD基序。
研究结论
昆虫病原真菌普遍存在高度保守的ggs1基因，其编码蛋白具有GGPP合酶活性，参与初级代谢；ggs2可能参与次级代谢。该研究首次为昆虫病原真菌中GGPP合酶基因的克隆与功能分析提供了基础，并可用于开发高产萜类化合物的菌株。