Enhancing the flux of D-glucose to the pentose phosphate pathway in Saccharomyces cerevisiae for the production of D-ribose and ribitol
- 作者
- Mervi H. Toivari, Hannu Maaheimo, Merja Penttilä, Laura Ruohonen
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2009）
- DOI
- 10.1007/s00253-009-2184-4
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
提高酿酒酵母中D-葡萄糖进入磷酸戊糖途径（PPP）的通量，以实现D-核糖和核糖醇的高效生产。pgi1缺陷菌株无法在葡萄糖上生长，且PPP通量有限，导致产率不高。
研究策略
通过敲除磷酸葡萄糖异构酶（PGI1）强制葡萄糖全部经PPP代谢，并引入NADPH消耗反应（GDH2或gapB）恢复pgi1菌株在葡萄糖上的生长；过表达糖磷酸磷酸酶（DOG1）将PPP中间产物去磷酸化生成D-核糖和核糖醇；同时构建pgi1 tkl1 tkl2菌株阻断非氧化PPP，形成“封闭”生产途径。
核心内容
该研究通过代谢工程策略改造酿酒酵母，以提高D-葡萄糖向磷酸戊糖途径（PPP）的通量，实现D-核糖和核糖醇的生产。研究者敲除磷酸葡萄糖异构酶基因PGI1强制葡萄糖全部经PPP代谢，同时引入NADPH消耗反应（枯草芽孢杆菌gapB或内源GDH2）恢复pgi1缺陷菌株在葡萄糖上的生长；并过表达糖磷酸磷酸酶DOG1将PPP中间产物去磷酸化为目标产物。进一步构建pgi1 tkl1 tkl2菌株阻断非氧化PPP，形成封闭生产途径。结果显示，CEN.PK2-1D菌株同时表达gapB和DOG1，在20 g/L果糖和4 g/L葡萄糖条件下产生约0.4 g/L D-核糖和核糖醇；而pgi1 tkl1 tkl2菌株表达DOG1和GDH2，在20 g/L果糖和2 g/L葡萄糖条件下产量提升至1 g/L，葡萄糖消耗产率达50%（w/w）。NMR分析证实约60%的D-核糖直接来源于D-葡萄糖。该策略利用pgi1缺陷强制碳流进入PPP并结合NADPH消耗反应恢复生长，为从葡萄糖合成戊糖类化合物提供了可行平台，但菌株对葡萄糖的耐受性仍需进一步提高。
创新点
利用pgi1缺陷强制葡萄糖流向PPP；引入枯草芽孢杆菌NADPH依赖的甘油醛-3-磷酸脱氢酶gapB作为NADPH消耗反应；将转酮醇酶缺失与pgi1缺陷结合，阻断产物进一步代谢；采用NMR直接分析产物来源。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 糖酵解 | PGI1 | Pgi1p (phosphoglucose isomerase) | 催化 | 敲除该基因，使葡萄糖无法通过糖酵解代谢，强制进入PPP |
| Saccharomyces cerevisiae | 谷氨酸代谢 | GDH2 | Gdh2p (NAD+-dependent glutamate dehydrogenase) | 催化 | 过表达以消耗NADPH，恢复pgi1菌株在葡萄糖上的生长 |
| Saccharomyces cerevisiae | 糖酵解 | gapB | GapB (NADPH-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) | 催化 | 来自Bacillus subtilis，过表达消耗NADPH，恢复pgi1菌株生长 |
| Saccharomyces cerevisiae | 戊糖磷酸途径 | DOG1 | Dog1p (sugar phosphate phosphatase) | 催化 | 过表达以去磷酸化D-核糖-5-磷酸和D-核酮糖-5-磷酸，促进产物生成 |
| Saccharomyces cerevisiae | 戊糖磷酸途径 | TKL1, TKL2 | transketolase | 催化 | 敲除以阻断非氧化PPP，避免产物进一步代谢 |
关键发现
- CEN.PK2-1D菌株同时表达gapB和DOG1，在20 g/L D-果糖和4 g/L D-葡萄糖条件下，产生约0.4 g/L D-核糖和核糖醇
- NMR分析表明约60%的D-核糖来自D-葡萄糖
- pgi1 tkl1 tkl2菌株表达DOG1和GDH2，在20 g/L D-果糖和2 g/L D-葡萄糖条件下，产生1 g/L D-核糖和核糖醇，葡萄糖消耗产率达50%（w/w）。
研究结论
pgi1和pgi1 tkl1 tkl2酿酒酵母菌株可用于从D-葡萄糖生产D-核糖和核糖醇，引入NADPH消耗反应（Gdh2p或GapB）和Dog1p磷酸酶是有利的，但菌株对D-葡萄糖的耐受性仍需提高以实现高效生产。