Characterization of the versatile monooxygenase CYP109B1 from Bacillus subtilis
- 作者
- Marco Girhard, Tobias Klaus, Yogan Khatri, Rita Bernhardt, Vlada B. Urlacher
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2010）
- DOI
- 10.1007/s00253-010-2472-z
- 所属领域
- 生物催化
- 关键词
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解决的核心问题
CYP109B1是一种具有工业应用潜力的P450单加氧酶，但此前缺乏对其底物谱、电子传递伙伴和氧化特性的系统研究。本文旨在通过体外重构和底物筛查，全面表征该酶的底物选择性、电子传递需求及其区域选择性氧化能力。
研究策略
在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达并纯化CYP109B1，利用多种人工氧化还原蛋白（PdR/Pdx、AdR/Adx、FdR/Fdx、FdR/YkuN、FdR/YkuP、BMR）体外重构其催化活性；通过紫外-可见光谱测定底物诱导的I型光谱变化和结合常数KD；对脂肪酸、脂肪酸酯、醇、烷烃、萜烯、杂环化合物和甾体等30种底物进行转化，并通过GC/MS鉴定产物及区域选择性。
核心内容
该研究在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达并纯化了来自枯草芽孢杆菌的细胞色素P450单加氧酶CYP109B1，通过体外重构系统对其底物谱、电子传递伙伴依赖性和区域选择性氧化特性进行了系统表征。研究发现，牛肾上腺皮质铁氧还蛋白系统AdR-Adx是最高效的人工电子传递系统，对肉豆蔻酸的转化率可达99.1%，耦合效率为45.8%。CYP109B1对饱和脂肪酸（C13–C15）表现出优异的转化活性，其中肉豆蔻酸转化率达99%，并具有亚末端C11/C12位的高区域选择性；对α-和β-紫罗酮则展示出100%的区域选择性烯丙位羟基化，分别生成3-羟基-α-紫罗酮和4-羟基-β-紫罗酮，转化率分别为70%和91%。此外，1-癸醇转化率高达99.5%，偏好ω-2位羟基化。研究还发现吲哚可作为竞争性抑制剂。上述结果表明CYP109B1是一种底物谱广泛、区域选择性强的多功能P450酶，在香味化合物及精细化学品的生物催化合成中具有应用潜力。
创新点
首次系统评估CYP109B1的底物谱和多种异源电子传递系统；发现牛肾上腺皮质铁氧还蛋白系统（AdR-Adx）是最有效的人工电子传递系统（转化率99.1%，耦合45.8%）；揭示CYP109B1对饱和脂肪酸亚末端C11/C12位的高区域选择性；首次报道CYP109B1对α-和β-紫罗酮的100%区域选择性烯丙位羟基化；发现吲哚作为竞争性抑制剂。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| E. coli BL21(DE3) | 脂肪酸羟化；萜烯羟化 | yjiB | CYP109B1 | 催化 | 来自Bacillus subtilis 168的多功能P450单加氧酶 |
| E. coli BL21(DE3) | — | camA | putidaredoxin reductase (PdR) | 能量供给 | 来自Pseudomonas putida，提供电子 |
| E. coli BL21(DE3) | — | camB | putidaredoxin (Pdx) | 能量供给 | 来自Pseudomonas putida，铁硫蛋白 |
| E. coli BL21(DE3) | — | — | adrenodoxin reductase (AdR) | 能量供给 | 来自牛肾上腺皮质，黄素蛋白还原酶 |
| E. coli BL21(DE3) | — | — | adrenodoxin (Adx_4-108) | 能量供给 | 来自牛肾上腺皮质，截短的铁硫蛋白 |
| E. coli BL21(DE3) | — | fpr | flavodoxin reductase (FdR) | 能量供给 | 来自E. coli JM109 |
| E. coli BL21(DE3) | — | — | flavodoxin (Fdx) | 能量供给 | 来自E. coli JM109 |
| E. coli BL21(DE3) | — | ykuN | YkuN flavodoxin | 能量供给 | 来自Bacillus subtilis 168 |
| E. coli BL21(DE3) | — | ykuP | YkuP flavodoxin | 能量供给 | 来自Bacillus subtilis 168，校正后基因编码151个氨基酸 |
| E. coli BL21(DE3) | — | CYP102A1 (还原酶域) | BMR (reductase domain of CYP102A1) | 能量供给 | 来自Bacillus megaterium，不支持CYP109B1活性 |
关键发现
- CYP109B1表达产量为3570 nmol/L（160 mg/L）
- 饱和脂肪酸C13-C15转化率>98%，其中肉豆蔻酸（C14）达99%
- 脂肪酸甲酯和乙酯转化率最高分别为80%（肉豆蔻酸甲酯）和34%（肉豆蔻酸乙酯）
- α-紫罗酮转化率70%±6%，β-紫罗酮91%±2%，分别生成3-羟基-α-紫罗酮和4-羟基-β-紫罗酮
- 1-癸醇转化率99.5%，1-十二醇16.6%，1-十四醇11.8%，均偏好ω-2位
- 电子传递系统比较中，AdR-Adx转化率99.1%±0.7%（耦合45.8%±3.5%），FdR-YkuN转化率90.2%±6.6%（耦合12.3%±0.5%），PdR-Pdx转化率16.0%±1.4%（耦合2.4%±0.3%），FdR-Fdx转化率52.3%±4.0%（耦合7.5%±0.9%），FdR-YkuP转化率13.9%±0.9%（耦合1.8%±0.1%）
- KD值：棕榈酸228±27 μM，硬脂酸983±67 μM，亚油酸12±1 μM，α-紫罗酮205±6 μM，β-紫罗酮180±16 μM，吲哚24.5±3 μM
- 吲哚存在时，200 μM吲哚使肉豆蔻酸转化率从~94%降至~64%，10 mM吲哚时降至20%，显示竞争性抑制作用。
研究结论
CYP109B1是一种多功能P450单加氧酶，在AdR-Adx系统支持下可高效、区域选择性氧化多种底物，尤其对脂肪酸和紫罗酮具有高活性和高区域选择性，有望用于香味化合物和精细化学品的生物催化合成。