Production of geranylgeraniol on overexpression of a prenyl diphosphate synthase fusion gene in Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Chikara Ohto, Masayoshi Muramatsu, Shusei Obata, Eiji Sakuradani, Sakayu Shimizu
- 单位
- Bio Research Lab., Toyota Motor Corporation, 1 Toyota-cho, Toyota 471-8572, Japan; Division of Applied Life Sciences, Graduate School of Agriculture, Kyoto University, Kitashirakawa-oiwakecho, Sakyo-ku, Kyoto 606-8502, Japan; Department of Bioscience and Biotechnology, Faculty of Bioenvironmental Science, Kyoto Gakuen University, Sogabe-cho, Kameoka, Kyoto 621-8555, Japan
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2010）
- DOI
- 10.1007/s00253-010-2571-x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何在酿酒酵母中高效生产香叶基香叶醇（GGOH），并避免传统方法因鲨烯合酶缺陷需补充甾醇或导致生长抑制的问题。
研究策略
在酿酒酵母中过表达甲羟戊酸途径关键基因HMG1（HMG-CoA还原酶）和BTS1-ERG20融合基因（编码香叶基香叶基二磷酸合酶与法尼基二磷酸合酶融合蛋白），并采用原养型二倍体菌株在5L发酵罐中进行优化培养。
核心内容
该研究在酿酒酵母中通过代谢工程手段实现了香叶基香叶醇（GGOH）的高效生产。作者构建了BTS1-ERG20融合基因，将香叶基香叶基二磷酸合酶与法尼基二磷酸合酶偶联，同时过表达甲羟戊酸途径的关键限速酶基因HMG1。结果显示，融合基因策略使GGOH产量较单独表达BTS1提高8倍，且无需敲除鲨烯合酶基因或外源补充甾醇即可正常生产，避免了传统路径中生长抑制的问题。在5L发酵罐中，原养型二倍体菌株培养133.5小时后GGOH产量达到138.8 mg/L，鲨烯产量为60.0 mg/L；使用YEp游离表达载体较YIp整合型载体产量提升5倍。该产量显著高于文献报道的柠檬烯（5 mg/L）、紫杉二烯（1.3 mg/L）和番茄红素（22 mg/L）等微生物萜类生产水平。该工作首次实现微生物过量生产GGOH，证明融合蛋白策略对疏水性萜类化合物的生物合成具有普适性价值，为工业化生产GGOH及其衍生萜类提供了可行方案。
创新点
1）构建并过表达BTS1-ERG20融合基因，使GGOH产量较单独BTS1提高8倍；2）无需敲除鲨烯合酶基因或添加甾醇即可实现GGOH生产；3）首次实现微生物过量生产GGOH，5L发酵罐产量达138.8 mg/L。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae YPH499 | 甲羟戊酸途径 | HMG1 | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMG-CoA还原酶） | 催化 | 过表达该基因显著增强甲羟戊酸途径通量，是GGOH生产的关键 |
| Saccharomyces cerevisiae YPH499 | 萜类合成途径 | ERG20 | 法尼基二磷酸合酶 | 催化 | 催化IPP与DMAPP生成FPP，为GGPP合成提供底物 |
| Saccharomyces cerevisiae YPH499 | 萜类合成途径 | BTS1 | 香叶基香叶基二磷酸合酶 | 催化 | 催化FPP与IPP缩合生成GGPP，单独过表达可提升GGOH产量 |
| Saccharomyces cerevisiae YPH499 | 萜类合成途径 | BTS1-ERG20融合基因 | BTS1-ERG20融合蛋白（含香叶基香叶基二磷酸合酶和法尼基二磷酸合酶活性） | 催化 | 通过Gly-Ser连接肽融合，使GGOH产量比单独BTS1提高8倍 |
| Saccharomyces cerevisiae GGOH strain（原养型二倍体） | 甲羟戊酸途径/萜类合成途径 | HMG1和BTS1-ERG20融合基因 | HMG-CoA还原酶和BTS1-ERG20融合蛋白 | 催化 | 在5L发酵罐中无需补充甾醇，GGOH产量达到138.8 mg/L |
关键发现
- 过表达BTS1-ERG20融合基因使GGOH产量比单独BTS1提高8倍
- 在5L发酵罐中，原养型二倍体菌株（GGOH strain）培养133.5 h后GGOH产量达138.8 mg/L，鲨烯产量60.0 mg/L，FOH在61.5 h达最大2.09 mg/L
- YEp载体较YIp载体GGOH产量提高5倍
- 试管培养YMO培养基中GGOH产量8.3 mg/L
- 与文献报道相比，GGOH产量显著高于柠檬烯（5 mg/L）、紫杉二烯（1.3 mg/L）和番茄红素（22 mg/L）。
研究结论
通过在酿酒酵母中过表达HMG1和BTS1-ERG20融合基因，无需补充甾醇或破坏鲨烯合酶基因即可高效生产GGOH，5L发酵罐产量达138.8 mg/L。这是首次实现微生物过量生产GGOH，证明融合蛋白策略对疏水性萜类生产有效。