A proteomic and transcriptional view of acidogenic and solventogenic steady-state cells of Clostridium acetobutylicum in a chemostat culture
- 作者
- Holger Janssen, Christina Döring, Armin Ehrenreich, Birgit Voigt, Michael Hecker, Hubert Bahl, Ralf-Jörg Fischer
- 单位
- Abteilung Mikrobiologie, Institut fur Biowissenschaften, Universitat Rostock, Albert-Einstein-Str. 3, 18051 Rostock, Germany; Abteilung Allgemeine Mikrobiologie, Institut fur Mikrobiologie und Genetik, Georg-August-Universitat Gottingen, Grisebachstr. 8, 37077 Gottingen, Germany; Institut fur Mikrobiologie, Ernst-Moritz-Arndt-Universitat Greifswald, Friedrich-Ludwig-Jahn-StraBe 15, 17487 Greifswald, Germany; Lehrstuhl fur Mikrobiologie, Technische Universitat Munchen, Am Hochanger 4, 85350 Freising, Germany
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2010）
- DOI
- 10.1007/s00253-010-2741-x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)从产酸代谢向产溶剂代谢转换的调控机制，并在稳定可控的恒化培养条件下系统比较产酸与产溶剂稳态细胞的蛋白质组和转录组差异。
研究策略
利用磷酸盐限制恒化培养，通过改变pH（5.7产酸，4.5产溶剂）使细胞分别处于产酸或产溶剂的稳态，然后采用二维凝胶电泳结合质谱进行蛋白质组分析，并用全基因组DNA微阵列进行转录组分析，同时用Northern blot验证关键基因表达。
核心内容
该研究利用磷酸盐限制恒化培养系统，通过调节pH分别为5.7和4.5，使丙酮丁醇梭菌稳定处于产酸和产溶剂两种代谢状态，实现了产溶剂代谢与孢子形成的严格解偶联。研究综合运用二维凝胶电泳结合质谱的蛋白质组分析和全基因组DNA微阵列的转录组分析，系统比较了两类稳态细胞的分子差异。结果显示，产酸期和产溶剂期分别有15和29个蛋白点显著增加，转录组中分别有53和95个基因上调，约66%的基因表达无显著变化。产酸期标志蛋白CAP0037和CAP0036的转录水平分别上调217.7倍和144.9倍，且仅在产酸期检出其mRNA；产溶剂期sol操纵子（adhE1、ctfA、ctfB）转录水平上调约125倍。该工作明确了pH是驱动代谢转换的关键因素，建立了高重现性的蛋白质参考图谱，并揭示了未知蛋白CAP0037/CAP0036可能参与调控代谢转换，为深入理解该菌的代谢调控机制提供了系统生物学基础。
创新点
['首次对恒化培养的产酸和产溶剂稳态细胞进行系统的蛋白质组和转录组分析', '实现了产溶剂代谢与孢子形成的严格解偶联，便于单独研究代谢转换', '建立了高重现性的胞浆蛋白质参考图谱，覆盖超过21%的可溶性蛋白', '发现未知功能蛋白CAP0037/CAP0036为产酸期特征性标志蛋白']
研究对象（22）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 产酸代谢（未知功能） | CA_P0037 | CAP0037 | 调控 | 未知功能蛋白，与枯草芽孢杆菌YgaS同源，产酸期特异高表达，mRNA平均上调217.7倍 |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 产酸代谢（未知功能） | CA_P0036 | CAP0036 | 调控 | 未知功能蛋白，与枯草芽孢杆菌YgaT同源，产酸期特异高表达，mRNA平均上调144.9倍 |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 丁醇合成 | CA_P0162 (adhE1) | AdhE1 | 催化 | 醛醇脱氢酶，产溶剂期特异表达，转录上调约125倍 |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 溶剂生成（丙酮/丁醇） | CA_P0163 (ctfA) | CtfA | 催化 | 丁酸-乙酰乙酸辅酶A转移酶亚基A，产溶剂期特异表达 |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 溶剂生成（丙酮/丁醇） | CA_P0164 (ctfB) | CtfB | 催化 | 丁酸-乙酰乙酸辅酶A转移酶亚基B，产溶剂期特异表达 |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 丁醇合成 | CAC3298 (bdhB) | BdhB | 催化 | NADH依赖性丁醇脱氢酶B，产溶剂期蛋白丰度显著增加 |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 丁酸/丁醇合成 | CAC2873 (thlA) | ThlA | 催化 | 乙酰辅酶A乙酰转移酶，产酸期转录上调约3.9倍 |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 丁酸/丁醇合成 | CAC2712 (crt) | Crt | 催化 | 烯酰辅酶A水合酶，产酸期转录上调约3.5倍 |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 丁酸/丁醇合成 | CAC2711 (bcd) | Bcd | 催化 | 丁酰辅酶A脱氢酶，产酸期转录上调约3.1倍 |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 丁酸/丁醇合成的电子传递 | CAC2709 (etfA) | EtfA | 能量供给 | 电子转移黄素蛋白α亚基，产酸期转录上调约3.0倍 |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 丁酸/丁醇合成的电子传递 | CAC2710 (etfB) | EtfB | 能量供给 | 电子转移黄素蛋白β亚基，产酸期蛋白丰度约2.5倍，转录上调3.0-3.5倍 |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 丁酸合成 | CAC3076 (ptb) | Ptb | 催化 | 磷酸转丁酰酶，产酸期转录上调约5.2倍 |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 丁酸合成 | CAC3075 (buk) | Buk | 催化 | 丁酸激酶，产酸期转录上调约5.1倍 |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 蛋白质分泌 | CAC2846 (secA) | SecA | 转运 | 蛋白转位酶亚基，产溶剂期蛋白丰度约2.3倍 |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 糖转运 | CAC3237 (msmX) | MsmX | 转运 | 糖ABC转运体ATP结合蛋白，产酸期转录上调约5.9倍 |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 甘油-3-磷酸转运 | CAC0429 | 甘油-3-磷酸ABC转运体周质组分 | 转运 | 产酸期转录上调约5.7倍 |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 双组分信号转导 | CAC3220 | 响应调节器 | 调控 | 产溶剂期蛋白丰度约2.2倍 |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 转录调控 | CAC2052 | σ因子 | 调控 | 产溶剂期转录下调（平均0.30倍） |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 糖代谢调控 | CAC0231 | 糖代谢转录调节因子 | 调控 | 产酸期转录上调约5.5倍 |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 孢子形成 | CAC2365 (sspA) | SspA | 区室化 | 小酸溶性孢子蛋白，产酸期转录上调约11倍，但恒化培养中未观察到孢子 |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 细胞表面结构 | CAC3558 | 可能的S层蛋白 | 区室化 | 产酸期蛋白丰度增加（混合斑点中） |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 一氧化碳代谢 | CAC0116 | 一氧化碳脱氢酶β链 | 催化 | 产溶剂期蛋白丰度约2.1倍 |
关键发现
- 通过磷酸盐限制恒化培养，在pH
- 7和pH
- 5下分别获得产酸和产溶剂的稳态细胞（OD 5±0.5），稳态时乙酸约35 mM、丁酸约60 mM。蛋白质组分析覆盖>21%的预期蛋白（pI 4-7，10-200 kDa），产酸细胞检出357个蛋白点（178个不同蛋白），产溶剂细胞检出415个蛋白点（205个不同蛋白）。产酸期有15个蛋白点显著增加，产溶剂期有29个蛋白点显著增加。转录组分析显示产酸期53个基因上调，产溶剂期95个基因上调，66.3%的基因无显著变化。产酸期标志蛋白CAP0037和CAP0036的转录水平分别平均上调217.7倍和144.9倍，且其mRNA仅存在于产酸期细胞。产溶剂期sol操纵子（adhE1、ctfA、ctfB）转录水平约上调125倍。此外，丁酸合成相关基因ptb和buk上调约5倍。
研究结论
本研究建立了基于恒化培养稳态细胞的蛋白质组和转录组参考数据集，证明pH是决定产酸/产溶剂代谢转换的关键因素，并成功将产溶剂与孢子形成过程解偶联。未知蛋白CAP0037/CAP0036在产酸期特异性高表达，可能参与代谢转换的调控。这些数据为深入理解C. acetobutylicum代谢调控和系统生物学研究提供了可靠基础。