Metabolic engineering to improve ethanol production in Thermoanaerobacter mathranii
- 作者
- Shuo Yao, Marie Just Mikkelsen
- 单位
- BioScience and Technology Group, BioCentrum, Technical University of Denmark; BioGasol ApS; Biosystems Department, Riso National Laboratory for Sustainable Energy, Technical University of Denmark
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2010）
- DOI
- 10.1007/s00253-010-2703-3
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
Thermoanaerobacter mathranii 能在高温下利用木质纤维素生物质生产乙醇，但乙醇产量低，需要代谢工程改造以提高乙醇得率，尤其是解决辅因子（NADH）再生不足的问题。
研究策略
删除乳酸脱氢酶基因ldh以消除NADH氧化旁路，同时异源表达来自Thermotoga maritima的NAD+依赖性甘油脱氢酶gldA，引入甘油氧化途径以再生NADH，使碳流和电子流向乙醇生产方向转移，并赋予菌株利用甘油作为额外碳源的能力。
核心内容
该研究通过代谢工程改造嗜热厌氧菌Thermoanaerobacter mathranii，旨在提升其以木质纤维素生物质为底物的乙醇产量。策略上，研究者删除了乳酸脱氢酶基因ldh以阻断NADH氧化的竞争性旁路，同时异源表达来自Thermotoga maritima的NAD⁺依赖性甘油脱氢酶gldA，引入甘油氧化途径以补充NADH再生，从而驱动碳流和电子流向乙醇生产转移，并赋予菌株利用甘油的能力。在关键结果中，重组菌株BG1G1（Δldh, Pxy/GldA）在木糖与甘油共底物条件下乙醇得率达0.63 Cmol/Cmol，比仅敲除ldh的BG1L1提高18.9%；连续发酵中最高乙醇产率为0.25 g/L/h，最高得率达0.55 g/g消耗木糖，相当于理论最大值的108%，同时消耗约30%的甘油。此外，以甘露醇为碳源时野生型乙醇得率比葡萄糖高22.6%。相比之下，组成型表达gldA的BG1G2因NADH过量导致乳酸大量积累，乙醇得率降至0.20 Cmol/Cmol。这些结果证实，删除ldh并引入NAD⁺依赖性甘油脱氢酶能有效将代谢流向乙醇转移，为利用还原性底物提高乙醇产量提供了可行策略。
创新点
首次在T. mathranii中异源表达甘油脱氢酶，并组合ldh缺失，获得重组菌株BG1G1（Δldh, Pxy/GldA），该菌株表现出提高的乙醇得率并获得了利用甘油的能力；实现了超过理论最大值的乙醇得率（108%）。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Thermoanaerobacter mathranii BG1 | 乳酸发酵/乙醇发酵 | ldh | 乳酸脱氢酶 (LDH) | 催化 | 催化丙酮酸还原为乳酸，消耗NADH；删除该基因可消除NADH氧化旁路 |
| Thermoanaerobacter mathranii BG1G1 | 甘油利用/乙醇发酵 | gldA (来自Thermotoga maritima) | NAD+依赖性甘油脱氢酶 (GLDH) | 催化 | 在木糖诱导启动子Pxy下表达，催化甘油氧化为甘油酮，产生NADH，提高乙醇产量 |
| Thermoanaerobacter mathranii BG1G2 | 甘油利用/糖酵解 | gldA | GLDH | 催化 | 组成型表达，导致NADH过量，代谢流向乳酸，乙醇产量下降 |
| Thermoanaerobacter mathranii BG1 | 甘油利用/糖酵解 | dhaK, tpi | 二羟丙酮激酶 (DhaK) 和磷酸丙糖异构酶 (TPI) | 催化 | 内源存在的酶，将甘油氧化产物甘油酮磷酸化并异构化为糖酵解中间物，使甘油可作为碳源 |
关键发现
- 甘露醇作为更还原的碳源时，野生型乙醇得率比葡萄糖高22.6%，比木糖高9.1%
- BG1L1（Δldh）分别高8.5%和13.8%。重组菌BG1G1在木糖+甘油条件下乙醇得率达0.63 Cmol/Cmol（理论得率94.5%），比BG1L1提高18.9%
- 连续发酵中最高乙醇产率0.25 g/L/h，最高乙醇得率0.55 g/g消耗木糖（理论最大值的108%），同时消耗约30%的甘油。而组成型表达gldA的BG1G2菌株因NADH过量导致乳酸大量积累（木糖条件下乳酸得率0.49 Cmol/Cmol），乙醇得率降至0.20 Cmol/Cmol。
研究结论
通过删除ldh并异源表达NAD+依赖的甘油脱氢酶，成功将T. mathranii的代谢流向乙醇生产方向转移，同时赋予菌株利用甘油的能力，为利用还原性底物提高乙醇产量提供了有效策略。