Microbial production of meso-2,3-butanediol by metabolically engineered Escherichia coli under low oxygen condition
- 作者
- Zheng-Jun Li, Jia Jian, Xiao-Xing Wei, Xiao-Wen Shen, Guo-Qiang Chen
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2010）
- DOI
- 10.1007/s00253-010-2676-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在低氧条件下，大肠杆菌的混合酸发酵途径会生成乳酸、乙酸、乙醇等副产物，导致2,3-丁二醇的产量和产率较低，如何通过代谢工程手段实现高效生产meso-2,3-丁二醇。
研究策略
敲除大肠杆菌JM109中的ldhA、pta、adhE和poxB基因以阻断混合酸发酵副产物的生成；构建高拷贝质粒pEnBD，在组成型启动子Ppdc驱动下共表达来自枯草芽孢杆菌的alsS、alsD和来自肺炎克雷伯菌的budC基因，并在摇瓶和6-L发酵罐低氧条件下评估2,3-丁二醇的生产。
核心内容
本研究通过代谢工程改造大肠杆菌JM109，以实现低氧条件下meso-2,3-丁二醇的高效生产。研究首先系统敲除了混合酸发酵途径中的四个关键基因（ldhA、pta、adhE和poxB），阻断乳酸、乙酸和乙醇等副产物的生成通路，随后构建高拷贝质粒pEnBD，在组成型启动子驱动下共表达来自枯草芽孢杆菌的alsS、alsD和肺炎克雷伯菌的budC基因，形成完整的2,3-丁二醇合成途径。在6-L发酵罐1%溶氧条件下，四基因缺失突变体JM109LPAP/pEnBD的2,3-丁二醇产率由对照的0.20 g/g葡萄糖提高至0.43 g/g葡萄糖，提升一倍以上；低通气摇瓶培养中，突变体的乙酸产量仅为0.83 g/L，远低于野生型的2.84 g/L，乳酸和乙醇合成亦被显著抑制。结果表明，在有限氧供应下破坏混合酸发酵途径可改善细胞生长和葡萄糖摄取速率，从而显著提高2,3-丁二醇的产量和产率，但过低的氧供应会降低细胞生长速率，未来需进一步优化氧供给策略以平衡生产速率与产率。
创新点
系统敲除四个混合酸发酵关键基因（ldhA、pta、adhE、poxB）以减少副产物；构建三基因共表达质粒pEnBD，每个基因均受独立组成型启动子控制；首次在极低溶氧（1% DO）条件下实现2,3-丁二醇作为主要发酵产物，产率较对照提高一倍以上。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| E. coli JM109 | — | — | — | — | 原始宿主菌，作为基因操作和对照菌株 |
| E. coli JM109LPAP | — | — | — | — | 四基因缺失突变体（ΔldhA Δpta ΔadhE ΔpoxB），用于2,3-丁二醇生产 |
| E. coli JM109/JM109LPAP | 2,3-丁二醇合成通路 | alsS | 乙酰乳酸合酶 | 催化 | 来自Bacillus subtilis，催化丙酮酸生成乙酰乳酸 |
| E. coli JM109/JM109LPAP | 2,3-丁二醇合成通路 | alsD | 乙酰乳酸脱羧酶 | 催化 | 来自Bacillus subtilis，催化乙酰乳酸生成乙偶姻 |
| E. coli JM109/JM109LPAP | 2,3-丁二醇合成通路 | budC | 乙偶姻还原酶 | 催化 | 来自Klebsiella pneumoniae，催化乙偶姻生成meso-2,3-丁二醇 |
| E. coli JM109 | 混合酸发酵通路 | ldhA | D-乳酸脱氢酶 | 催化 | 被敲除以阻断乳酸生成 |
| E. coli JM109 | 混合酸发酵通路 | pta | 磷酸转乙酰酶 | 催化 | 被敲除以减少乙酸生成 |
| E. coli JM109 | 混合酸发酵通路 | adhE | 乙醛脱氢酶/乙醇脱氢酶 | 催化 | 被敲除以减少乙醇生成 |
| E. coli JM109 | 混合酸发酵通路 | poxB | 丙酮酸氧化酶 | 催化 | 被敲除以进一步减少乙酸生成 |
关键发现
- 在1% DO的6-L发酵罐中，四基因缺失突变体（JM109LPAP/pEnBD）的2,3-丁二醇产率由对照的0.20 g/g葡萄糖提高到0.43 g/g葡萄糖
- 低通气摇瓶培养中，突变体产生的乙酸（0.83 g/L）远低于野生型（2.84 g/L），且乳酸和乙醇合成被显著抑制
- 在3% DO下，突变体比野生型对照更快地将葡萄糖转化为2,3-丁二醇
- 在1% DO下，重组突变体生长缓慢但2,3-丁二醇成为主要发酵产物。
研究结论
在有限氧供应下，破坏混合酸发酵途径可改善细胞生长和葡萄糖摄取速率，从而显著提高2,3-丁二醇的产量和产率；但过低的氧供应会降低细胞生长和转化速率，未来需进一步优化氧供给策略以平衡生产率和产率。