Characterization of alcohol dehydrogenase 1 of the thermotolerant methylotrophic yeast Hansenula polymorpha
- 作者
- Surisa Suwannarangsee, Doo-Byoung Oh, Jeong-Woo Seo, Chul Ho Kim, Sang Ki Rhee, Hyun Ah Kang, Warawut Chulalaksanankul, Ohsuk Kwon
- 单位
- Integrative Omics Research Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology; Microbe-based Fusion Technology Research Center, Jeonbuk Branch Institute, KRIBB; Department of Medical Biotechnology, Soonchunhyang University; Department of Life Science, College of Natural Science, Chung-Ang University; Biofuel Production by Biocatalyst Research Unit and Department of Botany, Faculty of Science, Chulalongkorn University
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2010）
- DOI
- 10.1007/s00253-010-2752-7
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
耐热甲基营养酵母 H. polymorpha 中乙醇脱氢酶（ADH）系统尚未被表征，缺乏对其主要 ADH 的分子和生理认识，限制了该菌株作为生物乙醇生产宿主的优化与改造。
研究策略
从全基因组中鉴定 HpADH1 基因，通过基因敲除和功能互补研究其生理作用；在大肠杆菌中异源表达并纯化重组蛋白，测定酶动力学参数和底物特异性；比较野生型、敲除突变型和互补菌株在不同碳源（葡萄糖、甘油）培养基中的生长、ADH 活性及乙醇产量。
核心内容
该研究首次对耐热甲基营养酵母Hansenula polymorpha的主要乙醇脱氢酶HpADH1进行了系统鉴定与功能表征。通过全基因组鉴定获得HpADH1基因，采用基因敲除、功能互补及大肠杆菌异源表达纯化等手段，解析了该酶的分子特性和生理作用。HpADH1为细胞质蛋白，分子量约36,671 Da，与酿酒酵母Adh1/Adh2的氨基酸同一性分别为75%和76%。酶动力学测定显示，重组HpADH1对乙醇氧化的催化效率达8.4×10^5 min^-1 mM^-1，显著高于其他酵母ADH，对C2-C5中链脂肪醇具有高氧化活性但对甲醇无活性。敲除HpADH1后，突变株总ADH活性仅为野生型的6%，葡萄糖或甘油培养基中乙醇产量不足野生型的四分之一，证明其是H. polymorpha乙醇发酵的关键酶。通过组成型过表达HpADH1进行功能互补，菌株ADH活性较野生型提高约3倍，在10%葡萄糖培养基中乙醇产量最高达36.7 g/L。研究结果表明，HpADH1在葡萄糖发酵和乙醇生产中发挥核心作用，优化其表达是开发高效生物乙醇生产菌株的有效策略。
创新点
首次鉴定并表征 H. polymorpha 的 ADH1 基因及蛋白；发现 HpADH1 对乙醇氧化具有明显高于其他酵母 ADH 的催化效率（Kcat/Km = 8.4×10^5 min^-1 mM^-1）；通过组成型过表达 HpADH1，使乙醇产量显著提升至 36.7 g/L。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Hansenula polymorpha DL-1 | 乙醇发酵 | HpADH1 | HpADH1 | 催化 | 主要乙醇脱氢酶，催化乙醛还原为乙醇及逆反应，对乙醇氧化具有高催化效率 |
| Hansenula polymorpha DL1-L | 乙醇发酵 | HpADH1 | HpADH1 | 催化 | 野生型菌株，用于基因敲除和互补研究，HpADH1 组成型表达 |
| Hansenula polymorpha ΔHpADH1 | 乙醇发酵 | HpADH1 | HpADH1 | 催化 | ADH1 敲除突变株，总 ADH 活性仅为野生型的 6%，乙醇产量显著降低 |
| Hansenula polymorpha pDLG-ADH1/ΔHpADH1 | 乙醇发酵 | HpADH1 | HpADH1 | 催化 | 功能互补菌株，由 PGAPDH 启动子过表达 HpADH1，ADH 活性比野生型高 3 倍，10% 葡萄糖发酵产乙醇达 36.7 g/L |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 重组蛋白表达 | HpADH1 | 6×His-HpADH1 | 催化 | 用于 HpADH1 的异源表达与纯化，进行酶动力学和底物特异性表征 |
关键发现
- HpADH1 是细胞质蛋白，其氨基酸序列与其它酵母 ADH 的相似性为 83%-89%，与 ScADH1/ScADH2 的同一性分别为 75% 和 76%；分子量约 36,671 Da。重组 HpADH1 对乙醇的 Km 为
- 25 mM，Kcat 为
- 1×10^5 min^-1，Kcat/Km 为
- 4×10^5 min^-1 mM^-1；对乙醛的 Km 为
- 94 mM，Kcat 为
- 0×10^5 min^-1，Kcat/Km 为
- 0×10^5 min^-1 mM^-1。HpADH1 对 C2-C5 中链脂肪醇氧化活性高，对甲醇无活性；乙醛还原相对活性为乙醇氧化的 1346%。ΔHpADH1 突变株总 ADH 活性仅为野生型的 6%，在葡萄糖或甘油培养基中乙醇产量低于野生型的四分之一。互补菌株（pDLG-ADH1/ΔHpADH1）的 ADH 活性比野生型高约 3 倍，在 10% 葡萄糖培养基中于第 4 天达到最高乙醇产量
- 7 g/L；在 10% 甘油培养基中乙醇产量约 4 g/L，与大肠杆菌相当。HpADH1 在葡萄糖、甘油、木糖和乙醇条件下组成型表达。
研究结论
HpADH1 是 H. polymorpha 的主要乙醇脱氢酶，在葡萄糖发酵和乙醇生产中起关键作用；过表达 HpADH1 可显著提高乙醇产量，优化 ADH1 表达是开发 H. polymorpha 高效生物乙醇生产菌株的理想策略。