Biotransformation of carotenoids to retinal by carotenoid 15,15'-oxygenase
- 作者
- Yeong-Su Kim, Deok-Kun Oh
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2010）
- DOI
- 10.1007/s00253-010-2823-9
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
如何利用类胡萝卜素15,15'-加氧酶（CO）将类胡萝卜素生物转化为视黄醛，以替代存在纯化步骤复杂、产生化学废料和副产物等缺点的化学合成法，实现视黄醛的生物制造。
研究策略
系统综述CO的生化性质、反应机制和底物特异性；通过优化水相中去垢剂胶束溶解类胡萝卜素的条件提高视黄醛酶法产量；提出利用代谢工程大肠杆菌和未表征的Brp/Blh蛋白生产视黄醛的新策略。
核心内容
该研究系统综述了类胡萝卜素15,15'-加氧酶（CO）催化类胡萝卜素裂解生成视黄醛的酶法生物转化策略，旨在替代步骤繁琐、产生化学废料的传统化学合成法。研究者系统比较了人、鸡、海洋细菌等来源CO的生化性质与底物特异性，发现β-胡萝卜素为最适底物，酶最适pH多在8.0，脊椎动物及海洋细菌来源酶最适温度37–40℃，Fe2+为必需辅因子。通过以甲苯为溶剂并优化Tween系列去垢剂胶束组成，人BCMO在2.4% Tween 80、酶0.2 U/ml、β-胡萝卜素200 mg/l条件下产视黄醛98 mg/l，转化率49%（w/w）；未培养海洋细菌BCDO在2.4% Tween 20条件下产量达181 mg/l，转化率52%（w/w），为当时报道的最高浓度。进一步将海洋细菌BCDO基因导入产β-胡萝卜素大肠杆菌，在含甘油2YT培养基中实现全细胞合成视黄醛137 mg/l。该工作证明酶法转化条件温和、无副产物，并展示了代谢工程大肠杆菌生产视黄醛的可行性，同时提出未表征的微生物Brp/Blh蛋白可作为新型合成酶源，为视黄醛工业化生物制造奠定了基础。
创新点
提出以甲苯为溶剂并优化Tween系列去垢剂胶束组成，显著提高人BCMO和海洋细菌BCDO的视黄醛产量；首次报道将未培养海洋细菌BCDO基因导入产β-胡萝卜素大肠杆菌实现全细胞合成视黄醛（137 mg/l）；建议将未表征的微生物Brp和Blh蛋白作为新型视黄醛合成酶源。
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtE, crtB, crtI, crtY | GGPP合酶、八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素脱饱和酶、番茄红素β-环化酶 | 催化 | 代谢工程改造用于生产β-胡萝卜素，再经BCDO转化为视黄醛 |
| Escherichia coli | MEP途径与甲羟戊酸途径 | dxs, dxr, cms, cmk, mecps, ispA, idi, atoB, mvaA, mvaS, mvaK1, mvaK2, mvaD | MEP/甲羟戊酸途径酶系 | 催化 | 合成异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）前体 |
| 未培养海洋细菌 (uncultured marine bacterium) | 视黄醛合成途径 | blh | Blh（β-胡萝卜素15,15'-双加氧酶, BCDO） | 催化 | 将β-胡萝卜素裂解为两分子视黄醛；优化条件下产181 mg/l视黄醛，为报道最高浓度 |
| 人 (Homo sapiens) | 维生素A合成途径 | BCMO1 | 人β-胡萝卜素15,15'-单加氧酶（BCMO） | 催化 | 最适条件下产98 mg/l视黄醛，转化率49%（w/w） |
| 小鼠 (Mus musculus) | 维生素A合成途径 | BCMO1 | 小鼠β-胡萝卜素15,15'-单加氧酶（BCMO） | 催化 | 在200 mg/l β-胡萝卜素下产72 mg/l视黄醛，转化率36%（w/w） |
| 鸡 (Gallus gallus) | 维生素A合成途径 | BCMO | 鸡β-胡萝卜素15,15'-单加氧酶（BCMO） | 催化 | 报道最高转化率60%（w/w） |
| 大鼠 (Rattus norvegicus) | 维生素A合成途径 | BCMO | 大鼠β-胡萝卜素15,15'-单加氧酶（BCMO） | 催化 | 对β-胡萝卜素Km=5.7 μM（文献值） |
| Synechocystis sp. PCC6803 | 脱辅基类胡萝卜素裂解/视黄醛合成途径 | aco | 脱辅基类胡萝卜素15,15'-加氧酶（ACO） | 催化 | 催化脱辅基类胡萝卜素裂解产生视黄醛；晶体结构已解析，Fe2+由His183/His238/His304/His484配位 |
| Nostoc sp. PCC7120 | 脱辅基类胡萝卜素裂解/视黄醛合成途径 | aco | 脱辅基类胡萝卜素15,15'-加氧酶（ACO） | 催化 | 对β-脱辅基-8'-胡萝卜素醇Km=25 μM、Vmax=157 nmol mg-1 min-1 |
| Fusarium fujikuroi | 视黄醛合成途径 | carX | 类胡萝卜素加氧酶 CarX | 催化 | 底物特异性与脊椎动物BCMO类似，对β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素和β-脱辅基-8'-胡萝卜素醇有活性 |
| 果蝇 (Drosophila melanogaster) | 维生素A合成途径 | BCO | 果蝇β-胡萝卜素15,15'-加氧酶 | 催化 | 最适温度27-30℃，分子量70 kDa |
| Halobacterium sp. NRC-1 / Haloarcula marismortui / Salinibacter ruber 等 | 视黄醛合成途径 | brp, blh | Brp（bacterioopsin相关蛋白）、Blh（bacteriopsis相关蛋白样同源蛋白） | 催化 | 未表征的候选视黄醛合成酶，建议作为新酶源 |
关键发现
- 人BCMO在优化条件下（Tween 80
- 4%、酶0.2 U/ml、β-胡萝卜素200 mg/l）产视黄醛98 mg/l，转化率49%（w/w）；未培养海洋细菌BCDO在优化条件下（2.4% Tween
- 0.15 U/ml、β-胡萝卜素350 mg/l）产视黄醛181 mg/l，转化率52%（w/w），为报道的最高浓度；鸡BCMO转化率为60%（w/w），为报道的最高转化率，产视黄醛3.2 mg/l（底物5.37 mg/l）；重组大肠杆菌表达海洋细菌BCDO后在含甘油2YT培养基中产视黄醛137 mg/l；β-胡萝卜素为BCMO/BCDO最适底物，海洋细菌BCDO的Km=37 μM、Vmax=45 nmol mg-1 min-1，人BCMO的Km=7.1 μM、Vmax=10 nmol mg-1 min-1，鸡BCMO的Km=26 μM、Vmax=32 nmol mg-1 min-1；Nostoc sp. ACO对β-脱辅基-8'-胡萝卜素醇的Km=25 μM、Vmax=157 nmol mg-1 min-1，Synechocystis sp. ACO对β-脱辅基-8'-胡萝卜素醛的Km=2.5 μM、Vmax=20 nmol mg-1 min-1；CO最适pH多为8.0，最适温度脊椎动物及海洋细菌为37-40℃，F. fujikuroi和果蝇为27-30℃；Fe2+为必需辅因子，由四个保守组氨酸残基配位；BCMO/ACO为四聚体（54-60 kDa亚基），海洋细菌BCDO为二聚体（32 kDa亚基），F. fujikuroi和果蝇BCO分子量分别为78和70 kDa；Golden Rice 2的β-胡萝卜素含量为37 μg/g，是原Golden Rice的23倍。
研究结论
酶法生物转化类胡萝卜素生成视黄醛具有反应条件温和、无副产物生成等优势，是化学合成的可行替代方案；通过代谢工程改造大肠杆菌及利用未表征的Brp/Blh蛋白可实现视黄醛的生物生产，但相关生物方法仍处于早期阶段，未来CO有望实现视黄醛的工业化生产。