Genetic analysis around aminoalcohol dehydrogenase gene of Rhodococcus erythropolis MAK154: a putative GntR transcription factor in transcriptional regulation
- 作者
- Nobuyuki Urano, Michihiko Kataoka, Takeru Ishige, Shinji Kita, Keiji Sakamoto, Sakayu Shimizu
- 单位
- 京都大学大学院农学研究科应用生命科学专攻; 第一精细化学株式会社研究所; 大阪府立大学大学院生命环境科学研究科应用生命科学专攻
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2010）
- DOI
- 10.1007/s00253-010-2924-5
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
Rhodococcus erythropolis MAK154中氨基酸醇脱氢酶(AADH)表达水平低，限制了其作为生物催化剂生产手性氨基醇（如d-伪麻黄碱）的应用，需要揭示其调控机制并提高表达。
研究策略
对aadh基因周围约14 kb的DNA区域进行测序和遗传分析，鉴定候选调控基因orfE；通过同源重组构建orfE敲除突变株和含有多拷贝orfE的菌株，比较AADH活性和aadh转录水平。
核心内容
该研究围绕红平红球菌MAK154中氨基酸醇脱氢酶（AADH）表达调控机制展开，旨在解决其作为手性氨基醇生物催化剂时表达水平低的问题。作者对aadh基因周围约14 kb区域进行了测序与遗传解析，鉴定出一个编码GntR家族转录调控因子的候选基因orfE，并通过同源重组构建了orfE敲除菌株及携带多拷贝orfE的质粒菌株，比较了不同菌株的AADH活性和aadh转录水平。结果显示，敲除orfE的ΔorfE菌株无论是否添加诱导剂，产物EPE产量均可达约7 mg/ml，远高于诱导后野生型的约1 mg/ml；实时定量RT-PCR证实野生型中aadh转录在诱导时提高约100倍，而ΔorfE菌株的转录水平与诱导野生型相当。此外，在多拷贝质粒上过表达orfE的菌株即使加入诱导剂也完全丧失AADH活性。这些结果表明OrfE是aadh的负转录调控因子，无诱导物时抑制aadh表达，诱导物能够解除此抑制。敲除orfE可实现AADH的组成型高表达，获得的突变株在无诱导条件下即具备高产能力，为手性氨基醇的生物催化生产提供了一条简化发酵流程的可行菌株改造策略。
创新点
首次报道aadh基因周围存在一个编码GntR家族转录调控因子OrfE的基因，证明OrfE是aadh的负调控因子，并利用基因敲除获得了组成型高表达AADH的菌株。
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Rhodococcus erythropolis MAK154 | 氨基酸醇代谢 | aadh | AADH | 催化 | NADP+依赖的氨基酸醇脱氢酶，催化(S)-MAK还原为d-伪麻黄碱 |
| Rhodococcus erythropolis MAK154 | 氨基酸醇代谢 | orfE | OrfE | 调控 | GntR家族FadR亚家族转录因子，负调控aadh表达 |
| Rhodococcus erythropolis MAK154 | 氨基酸醇代谢 | orfV | OrfV | 转运 | 预测为氨基酸透性酶 |
| Rhodococcus erythropolis MAK154 | 氨基酸醇代谢 | orfW | OrfW | 催化 | 预测为鸟氨酸-氧-酸转氨酶 |
| Rhodococcus erythropolis MAK154 | 氨基酸醇代谢 | orfX | OrfX | 催化 | 预测为醛脱氢酶 |
| Rhodococcus erythropolis MAK154 | 氨基酸醇代谢 | orfY | OrfY | 区室化 | 含有BMC结构域，可能参与形成代谢体 |
| Rhodococcus erythropolis MAK154 | 氨基酸醇代谢 | orfA | OrfA | 区室化 | 与乙醇胺利用蛋白EutN同源，可能形成类羧基体多面体细胞器 |
| Rhodococcus erythropolis MAK154 | 氨基酸醇代谢 | orfB | OrfB | 区室化 | 与乙醇胺利用蛋白EutM同源 |
| Rhodococcus erythropolis MAK154 | 氨基酸醇代谢 | orfC | OrfC | 区室化 | 含有BMC结构域 |
| Rhodococcus erythropolis MAK154 | 氨基酸醇代谢 | orfD | OrfD | 催化 | 预测为氨基糖苷磷酸转移酶/高丝氨酸激酶 |
| Rhodococcus erythropolis MAK154 | 氨基酸醇代谢 | orfF | OrfF | 催化 | 预测为乙酰鸟氨酸脱乙酰酶 |
| Rhodococcus erythropolis MAK154 | 氨基酸醇代谢 | orfH | OrfH | 转运 | 预测为钠/溶质同向转运体 |
关键发现
- 在野生型MAK154中，添加1-氨基-2-丙醇诱导后AADH活性可产生约1 mg/ml EPE（产物），而敲除orfE的ΔorfE菌株无论是否诱导均产生约7 mg/ml EPE，AADH活性显著高于诱导的野生型
- 实时定量RT-PCR显示，野生型中aadh转录在有诱导剂时比无诱导剂高约100倍，而ΔorfE菌株的aadh转录水平与诱导的野生型相当
- 当在多拷贝质粒pKMAK309上表达orfE时，即使加入诱导剂，菌株也完全无AADH活性。
研究结论
OrfE是aadh的负转录调控因子，其在无诱导物时抑制aadh表达，有诱导物时解除抑制。敲除orfE可使AADH组成型高表达，该突变株有望用于手性氨基醇的生物催化生产。