β-Carotene production by Saccharomyces cerevisiae with regard to plasmid stability and culture media
- 作者
- Nicole Lange, Alexander Steinbüchel
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2011）
- DOI
- 10.1007/s00253-011-3315-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解决重组酿酒酵母生产β-胡萝卜素时质粒不稳定和培养基选择限制的问题，通过增强MVA通路提高质粒稳定性和产量。
研究策略
将来自金黄色葡萄球菌的甲羟戊酸激酶基因mvaK1与来自Xanthophyllomyces dendrorhous的类胡萝卜素合成基因（crtE、crtI、crtYB）共同构建于附加体质粒YEplac-CaroSA上，由adh1启动子组成型表达；通过erg12缺失突变体验证MvaK1功能；在YPD和YNB培养基中考察质粒稳定性及β-胡萝卜素积累。
核心内容
该研究针对重组酿酒酵母生产β-胡萝卜素时质粒不稳定和培养基选择受限的问题，将金黄色葡萄球菌的甲羟戊酸激酶基因mvaK1与来自Xanthophyllomyces dendrorhous的类胡萝卜素合成基因（crtE、crtI、crtYB）共表达于附加体质粒YEplac-CaroSA上。通过erg12缺失突变体互补实验证实MvaK1能替代内源Erg12功能，并系统考察了质粒稳定性与β-胡萝卜素积累。结果显示，在YPD培养基中β-胡萝卜素产量达14.3 mg/L，细胞干重为9 g/L；在YNB培养基中含量最高达3897 μg/g CDM，较文献值103 μg/g CDM提高约37倍。质粒稳定性实验表明，重组菌株在YPD和YNB中均未观察到分离型质粒丢失，而对照菌株在YPD中99%细胞丢失质粒。此外，新菌株中未检测到番茄红素，而对照菌株在YNB中积累2290 μg/g CDM番茄红素，表明MvaK1的引入显著增强了MVA通路通量，缓解了类胡萝卜素合成瓶颈。该策略使菌株能在非选择性复合培养基中稳定高效生产β-胡萝卜素，具备大规模发酵应用潜力，同时erg12缺失的质粒依赖型系统虽能维持质粒但未产生类胡萝卜素，提示需进一步优化萜类前体在类胡萝卜素与甾醇合成间的分配。
创新点
首次在酿酒酵母中表达金黄色葡萄球菌的甲羟戊酸激酶mvaK1并验证其功能；构建的质粒在非选择性培养基中具有高稳定性；实现了在复合培养基YPD中稳定生产β-胡萝卜素；β-胡萝卜素产量较文献提高约37倍；构建了基于erg12缺失的质粒依赖型系统。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae G175 | 甲羟戊酸（MVA）通路 | mvaK1 | 甲羟戊酸激酶（MvaK1） | 催化 | 来源于金黄色葡萄球菌，组成型表达，增强MVA通路，可互补ERG12缺失 |
| Saccharomyces cerevisiae G175 | 甲羟戊酸（MVA）通路 | ERG12 | 甲羟戊酸激酶（Erg12） | 催化 | 内源酶，被mvaK1替代/互补 |
| Saccharomyces cerevisiae G175 | 类胡萝卜素合成通路 | crtE | 香叶基香叶基焦磷酸合酶（CrtE） | 催化 | 来自Xanthophyllomyces dendrorhous，催化GGPP合成 |
| Saccharomyces cerevisiae G175 | 类胡萝卜素合成通路 | crtI | 八氢番茄红素脱饱和酶（CrtI） | 催化 | 来自Xanthophyllomyces dendrorhous，催化脱饱和 |
| Saccharomyces cerevisiae G175 | 类胡萝卜素合成通路 | crtYB | 双功能八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶（CrtYB） | 催化 | 来自Xanthophyllomyces dendrorhous，负责番茄红素环化生成β-胡萝卜素 |
| Saccharomyces cerevisiae G175 | 甲羟戊酸（MVA）通路 | ADH1p | — | 调控 | 驱动mvaK1组成型表达 |
| Saccharomyces cerevisiae G175 | 类胡萝卜素合成通路 | TDH3p | — | 调控 | 驱动类胡萝卜素基因组成型表达 |
关键发现
- 在YPD培养基中，重组菌株S. cerevisiae G175 (YEplac-CaroSA) 的β-胡萝卜素产量为14.3 mg/L，细胞干重为9 g/L
- 在YNB培养基中，最高β-胡萝卜素含量为3897 μg/g CDM，细胞密度为1 g CDM/L。质粒稳定性实验显示，在YPD和YNB中均未观察到分离型质粒丢失，仅约1%克隆出现结构不稳定
- 对照菌株在YPD中99%细胞丢失质粒，YNB中平均56%分离丢失。β-胡萝卜素含量由文献的103 μg/g CDM提高至3897 μg/g CDM，约37倍
- YPD中β-胡萝卜素含量为1570 μg/g CDM，为对照（263 μg/g CDM）的约6倍。新菌株中未检测到番茄红素，而对照菌株在YNB中番茄红素为2290 μg/g CDM。RT-PCR证实mvaK1在酿酒酵母中转录，erg12缺失突变体互补实验表明MvaK1能替代Erg12功能。
研究结论
通过表达异源甲羟戊酸激酶MvaK1，显著提高了β-胡萝卜素合成质粒在酿酒酵母中的稳定性，使菌株能够在非选择性复合培养基YPD中稳定生产β-胡萝卜素，产量和含量均大幅提升，具有大规模发酵生产的潜力。erg12缺失的addiction系统虽能维持质粒，但未产生类胡萝卜素，需进一步优化以解决萜类前体在类胡萝卜素与甾醇合成间的竞争。