Enhancement of carotenoids biosynthesis in Chlamydomonas reinhardtii by nuclear transformation using a phytochrome synthase gene isolated from Chlorella zofingiensis
- 作者
- Baldo F. Cordero, Inmaculada Couso, Rosa Leon, Herminia Rodriguez, M. Angeles Vargas
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2011）
- DOI
- 10.1007/s00253-011-3262-y
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
真核微藻中类胡萝卜素生物合成通量受限于八氢番茄红素合成酶（PSY）这一关键限速步骤，如何通过基因工程手段提高微藻类胡萝卜素产量。
研究策略
从产虾青素的绿藻 Chlorella zofingiensis 中分离并功能鉴定 PSY 基因（CzPSY），通过大肠杆菌异源互补验证其催化功能，随后将该基因置于强组成型启动子 rbcS2 和 hsp70A 控制下，利用核转化导入莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii），过表达外源 PSY 以增强类胡萝卜素合成。
核心内容
本研究从产虾青素的绿藻Chlorella zofingiensis中克隆了八氢番茄红素合成酶基因CzPSY（ORF 1263 bp，编码420个氨基酸），通过大肠杆菌功能互补实验证实其能催化两分子GGPP缩合生成八氢番茄红素。将该基因置于强组成型启动子rbcS2和hsp70A控制下，经核转化导入莱茵衣藻，约80%的抗性菌落经PCR确认含有插入片段。在阳性转化株中，紫黄质和叶黄素含量分别达到野生型的1.8–2.0倍和2.0–2.2倍；代表性转化株T10的紫黄质和叶黄素含量分别为野生型的2.0倍和2.2倍，而β-胡萝卜素和α-胡萝卜素水平基本不变。值得注意的是，转化株中CzPSY转录水平虽达内源PSY的140倍，但部分株系类胡萝卜素提升有限，提示存在转录后或翻译水平调控。该工作首次在莱茵衣藻中成功表达外源微藻PSY基因，证明碳流可被导向类胡萝卜素合成，为利用转基因微藻规模化生产商业类胡萝卜素提供了可行策略。
创新点
['首次从 Chlorella zofingiensis 中克隆并功能鉴定八氢番茄红素合成酶基因 CzPSY。', '首次在莱茵衣藻中成功表达外源微藻 PSY 基因，显著提高紫黄质和叶黄素含量。', '利用强组成型启动子使外源基因转录水平达到内源 PSY 的140倍，证明碳流可被导向类胡萝卜素合成。']
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Chlamydomonas reinhardtii | 类胡萝卜素生物合成途径 | CzPSY | 八氢番茄红素合成酶 | 催化 | 外源基因，在 rbcS2 和 hsp70A 强启动子下表达，使紫黄质和叶黄素分别提高2.0和2.2倍（T10株） |
| Escherichia coli BL21 (DE3) | 类胡萝卜素生物合成途径 | CzPSY | 八氢番茄红素合成酶 | 催化 | 与 pAC-85b 共转化，功能互补验证催化 GGPP 生成八氢番茄红素，最终积累 β-胡萝卜素 |
| Chlamydomonas reinhardtii | 类胡萝卜素生物合成途径 | CrPSY | 内源八氢番茄红素合成酶 | 催化 | 内源 PSY 基因，在转化株中表达水平与野生型相似，并非改变的直接靶点 |
| Chlorella zofingiensis | 类胡萝卜素生物合成途径 | CzPSY | 八氢番茄红素合成酶 | 催化 | 基因来源生物，该基因为单拷贝，编码蛋白具叶绿体转运肽（预测切割位点第45位） |
关键发现
- ['CzPSY cDNA 全长 2944 bp，ORF 1263 bp，编码 420 个氨基酸，预测分子量
- 64 kDa，理论等电点
- 53。', 'Southern blot 显示 CzPSY 在 C. zofingiensis 基因组中为单拷贝。', '大肠杆菌功能互补实验证实 CzPSY 催化两分子 GGPP 缩合生成八氢番茄红素，与 pAC-85b 共转化产生 β-胡萝卜素。', '在莱茵衣藻核转化株中，约80%的巴龙霉素抗性菌落经 PCR 确认含有 CzPSY 插入片段，约10%阳性株的紫黄质和叶黄素含量分别为野生型的1.8–2.0倍和2.0–2.2倍。', '代表性转化株 T10 中紫黄质含量为野生型的
- 0 倍，叶黄素含量为
- 2 倍，而 β-胡萝卜素和 α-胡萝卜素水平与野生型基本相同。', '转化株 T1 和 T10 中 CzPSY 转录水平达到内源 PSY 的 140 倍，但 T1 的紫黄质和叶黄素仅分别比野生型高 7% 和 21%，表明存在转录后/翻译调控。']
研究结论
通过核转化在莱茵衣藻中过表达 C. zofingiensis 的 PSY 基因可显著提高紫黄质和叶黄素积累，这是真核微藻类胡萝卜素代谢工程的成功案例，为利用转基因微藻规模化生产商业类胡萝卜素提供了可行策略。