Biosynthesis of zeaxanthin in recombinant Pseudomonas putida
- 作者
- Holger Beuttler, Jana Hoffmann, Marcel Jeske, Bernhard Hauer, Rolf D. Schmid, Josef Altenbuchner, Vlada B. Urlacher
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2010）
- DOI
- 10.1007/s00253-010-2961-0
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在重组Pseudomonas putida中实现玉米黄质的生物合成，克服类胡萝卜素对细胞的毒性，并提高产量。
研究策略
构建包含来自Pantoea ananatis的五个类胡萝卜素合成基因和E. coli的三个异戊二烯前体合成基因的质粒，通过转座子突变筛选耐受类胡萝卜素毒性的菌株，优化培养基和添加疏水添加剂（如卵磷脂）提高产量。
核心内容
本研究在重组恶臭假单胞菌中实现了玉米黄质的异源生物合成。研究者构建了携带潘多拉泛菌五个类胡萝卜素合成基因及大肠杆菌三个异戊二烯前体合成基因的质粒，通过转座子突变筛选耐受类胡萝卜素毒性的菌株，并优化培养基及添加疏水添加剂提升产量。在TB培养基中，重组菌株D7L3/pJH14的玉米黄质产量达51 mg/L（约7 mg/g细胞干重），产物纯度约80%。添加10%卵磷脂使体积产量提升4.7倍至239 mg/L，1%和5%卵磷脂分别提升3.3倍和4.2倍，1%油酸则提升2.3倍。与大肠杆菌相比，该菌株在TB培养基中产量更高。研究发现类胡萝卜素毒性主要由番茄红素引起，转座子突变株D7L3的转运蛋白基因发生插入突变。此外，β-胡萝卜素羟化酶对(3R,3'R)-玉米黄质具有立体选择性偏好。该工作首次报道了在恶臭假单胞菌中生产玉米黄质，证明卵磷脂等疏水添加剂可有效缓解产物毒性抑制，为利用该宿主生产疏水性类胡萝卜素提供了可行策略。
创新点
首次报道在Pseudomonas putida中生产玉米黄质；通过转座子突变鉴定类胡萝卜素毒性相关基因靶点；发现卵磷脂可以显著提高玉米黄质的体积产量。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pseudomonas putida D7L3; Escherichia coli JM109 | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtE | 香叶基香叶基焦磷酸合酶 | 催化 | 来自Pantoea ananatis，催化GGPP合成 |
| Pseudomonas putida D7L3; Escherichia coli JM109 | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtB | 八氢番茄红素合酶 | 催化 | 来自Pantoea ananatis，催化八氢番茄红素合成 |
| Pseudomonas putida D7L3; Escherichia coli JM109 | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtI | 八氢番茄红素脱饱和酶 | 催化 | 来自Pantoea ananatis，催化脱饱和生成番茄红素 |
| Pseudomonas putida D7L3; Escherichia coli JM109 | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtY | 番茄红素环化酶 | 催化 | 来自Pantoea ananatis，催化番茄红素环化生成β-胡萝卜素 |
| Pseudomonas putida D7L3; Escherichia coli JM109 | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtZ | β-胡萝卜素羟化酶 | 催化 | 来自Pantoea ananatis，催化β-胡萝卜素羟基化生成玉米黄质 |
| Pseudomonas putida D7L3; Escherichia coli JM109 | 甲基赤藓醇磷酸(MEP)途径 | idi | 异戊烯焦磷酸异构酶 | 催化 | 来自E. coli，催化IPP与DMAPP相互转化 |
| Pseudomonas putida D7L3; Escherichia coli JM109 | 甲基赤藓醇磷酸(MEP)途径 | ispA | 牻牛儿基/法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | 来自E. coli，催化IPP和DMAPP缩合生成GPP和FPP |
| Pseudomonas putida D7L3; Escherichia coli JM109 | 甲基赤藓醇磷酸(MEP)途径 | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | 来自E. coli，催化MEP途径第一步 |
关键发现
- 在TB培养基中，重组Pseudomonas putida D7L3/pJH14最高产量为51 mg/l（对应7 mg/g细胞干重），产物纯度约80%
- 添加10%卵磷脂可将体积产量提高4.7倍（51 mg/l vs 239 mg/l）
- 添加1%卵磷脂提高3.3倍，5%提高4.2倍
- 添加1%油酸提高2.3倍（第一天）。与E. coli相比，P. putida在TB培养基中产量更高（E. coli最高2.4 mg/g CDW）。类胡萝卜素毒性主要由番茄红素引起，转座子突变体D7L3在转运蛋白基因（GeneID 1044254）中插入突变。β-胡萝卜素羟化酶对(3R,3'R)-玉米黄质有偏好（手性分析峰面积比33:4:1，主峰与(3R,3'R)-标准品一致）。
研究结论
重组Pseudomonas putida D7L3可高效合成玉米黄质，且优于E. coli；卵磷脂等固体添加剂能有效提高产量；β-胡萝卜素羟化酶具有立体选择性。该研究为利用Pseudomonas putida生产疏水性类胡萝卜素提供了可行策略。