Mechanism of 2,3-butanediol stereoisomer formation in Klebsiella pneumoniae
- 作者
- Chuan Chen, Dong Wei, Jiping Shi, Min Wang, Jian Hao
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2014）
- DOI
- 10.1007/s00253-014-5526-9
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明肺炎克雷伯氏菌中2,3-丁二醇立体异构体的形成机制，尤其是2R,3R-丁二醇在该菌中产生的酶学基础。
研究策略
通过基因敲除（ΔbudA、ΔbudC、ΔdhaD）结合异源表达、体外酶学反应和产物分析，比较不同碳源下的代谢特征，验证甘油脱氢酶和丁二醇脱氢酶的立体选择性。
核心内容
本研究以肺炎克雷伯氏菌CGMCC 1.6366为对象，通过基因敲除（ΔbudA、ΔbudC、ΔdhaD）、异源表达和体外酶学反应，系统阐明了2,3-丁二醇立体异构体的形成机制。实验发现，以葡萄糖为碳源时野生菌主要积累meso-2,3-丁二醇（41.1 g/L），并产生少量2S,3S-和2R,3R-丁二醇，三者摩尔比为124:7:1；而以甘油为碳源时2R,3R-丁二醇比例显著升高至5.5 g/L，摩尔比变为2.6:0.18:1。基因敲除实验表明，dhaD编码的甘油脱氢酶是唯一能将R-乙偶姻还原为2R,3R-丁二醇的酶，ΔdhaD突变株完全丧失该产物合成能力；budC编码的丁二醇脱氢酶则负责双乙酰还原为S-乙偶姻并进一步生成2S,3S-丁二醇，ΔbudC突变株在甘油下积累19.0 g/L的2R,3R-丁二醇且无2S,3S-产物。体外酶活测定证实甘油脱氢酶对R-乙偶姻的还原活性为2.68 U/mg蛋白。该研究首次报道该菌株可产2R,3R-丁二醇，完整揭示了立体异构体的形成途径，并排除了乙偶姻外消旋酶的存在，为定向调控2,3-丁二醇立体构型提供了酶学基础。
创新点
首次报道肺炎克雷伯氏菌CGMCC 1.6366能够产生2R,3R-丁二醇；发现甘油脱氢酶（dhaD）具有2R,3R-丁二醇脱氢酶活性，负责从R-乙偶姻合成2R,3R-丁二醇；确立了完整的2,3-丁二醇立体异构体合成途径，并否定了乙偶姻外消旋酶的存在。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Klebsiella pneumoniae CGMCC 1.6366 | 2,3-丁二醇合成通路 | budA | α-乙酰乳酸脱羧酶 | 催化 | 催化α-乙酰乳酸脱羧生成R-乙偶姻；ΔbudA突变株2R,3R-丁二醇合成减少。 |
| Klebsiella pneumoniae CGMCC 1.6366 | 2,3-丁二醇合成通路 | budC | 丁二醇脱氢酶 | 催化 | 催化双乙酰还原为S-乙偶姻并进一步生成2S,3S-丁二醇，也可催化R-乙偶姻生成meso-2,3-丁二醇；ΔbudC突变株丧失2S,3S-丁二醇合成能力并积累R-乙偶姻。 |
| Klebsiella pneumoniae CGMCC 1.6366 | 甘油代谢（dha regulon） | dhaD | 甘油脱氢酶 | 催化 | 具有(R)-立体选择性，催化R-乙偶姻生成2R,3R-丁二醇，催化S-乙偶姻生成meso-2,3-丁二醇；ΔdhaD突变株完全失去2R,3R-丁二醇合成能力。 |
| Escherichia coli BL21 | 异源表达 | budC | 丁二醇脱氢酶 | 催化 | 异源表达用于体外酶学验证，确认其立体选择性。 |
| Escherichia coli BL21 | 异源表达 | dhaD | 甘油脱氢酶 | 催化 | 异源表达用于体外酶学验证，确认其立体选择性。 |
关键发现
- 以葡萄糖为碳源时，野生型肺炎克雷伯氏菌CGMCC 1.6366产meso-2,3-丁二醇41.1 g/L、R-乙偶姻1.8 g/L、S-乙偶姻0.6 g/L、2S,3S-丁二醇2.2 g/L、2R,3R-丁二醇0.3 g/L，摩尔比meso:2S,3S:2R,3R=124:7:1。以甘油为碳源时，产meso-2,3-丁二醇14.5 g/L、2S,3S-丁二醇1.0 g/L、2R,3R-丁二醇5.5 g/L、S-乙偶姻0.18 g/L、R-乙偶姻0.27 g/L，摩尔比meso:2S,3S:2R,3R=2.6:0.18:1。ΔbudA突变株在葡萄糖下meso-2,3-丁二醇产量降至2.0 g/L，无2R,3R-丁二醇
- 在甘油下meso、2S,3S、2R,3R-丁二醇分别为0.9、0.3、0.2 g/L。ΔbudC突变株在葡萄糖下R-乙偶姻累积高达18 g/L，2R,3R-丁二醇为0.8 g/L
- 在甘油下产生19.0 g/L的2R,3R-丁二醇，且无2S,3S-丁二醇。ΔdhaD突变株完全丧失合成2R,3R-丁二醇的能力，葡萄糖下meso-2,3-丁二醇为28.6 g/L，甘油下meso-2,3-丁二醇为1.2 g/L。体外酶活测定：丁二醇脱氢酶对双乙酰活性25.65 U/mg蛋白，对消旋乙偶姻10.33 U/mg，对R-乙偶姻8.92 U/mg
- 甘油脱氢酶对甘油氧化活性6.70 U/mg，对消旋乙偶姻5.91 U/mg，对R-乙偶姻2.68 U/mg，对双乙酰0.75 U/mg。
研究结论
肺炎克雷伯氏菌中，甘油脱氢酶（dhaD）是唯一负责将R-乙偶姻还原为2R,3R-丁二醇的酶，并可将S-乙偶姻还原为meso-2,3-丁二醇；丁二醇脱氢酶（budC）是唯一催化双乙酰转化为S-乙偶姻并进一步生成2S,3S-丁二醇的酶，同时也可将R-乙偶姻还原为meso-2,3-丁二醇。该研究完整揭示了2,3-丁二醇立体异构体的形成途径。