Isolation and characterization of a thermotolerant ene reductase from Geobacillus sp. 30 and its heterologous expression in Rhodococcus opacus
- 作者
- Naoto Tsuji, Kohsuke Honda, Mayumi Wada, Kenji Okano, Hisao Ohtake
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2014）
- DOI
- 10.1007/s00253-014-5668-9
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在无水有机溶剂反应介质中实现水不溶性底物的高效不对称生物催化还原，需要解决酶在有机溶剂中的稳定性以及底物传质受限的问题。
研究策略
从嗜热菌Geobacillus sp. 30中分离新型耐热烯还原酶，并异源表达于亲脂性细菌Rhodococcus opacus B-4中；同时从Thermus thermophilus基因表达文库中筛选出以环己醇为底物的NAD+依赖型醇脱氢酶（TtADH）用于辅因子再生。将共表达两种酶的重组R. opacus湿细胞直接分散在酮异佛尔酮/环己醇混合液中，在50°C下进行全细胞无水生物转化。
核心内容
本研究从嗜热菌Geobacillus sp. 30中分离纯化了一种新型耐热烯还原酶，该酶亚基分子量37.9 kDa，推测为三或四聚体，最适pH 8.0、最适温度70°C，在50°C下保温8小时仍保留>75%活性，并在80%乙醇中处理5分钟保留>85%活性，表现出优异的耐热和耐有机溶剂特性。针对酮异佛尔酮的Km为2.38 mM，kcat/Km为2.70 s-1 mM-1，产物对映体过量达88.1%（R）。将该烯还原酶与从Thermus thermophilus筛选得到的NAD+依赖型醇脱氢酶TtADH共表达于亲脂性细菌Rhodococcus opacus B-4中，湿细胞直接悬浮于酮异佛尔酮/环己醇混合液，在50°C无水条件下反应24小时，产物(6R)-levodione浓度达634 mM，对映选择性89.2% ee，初始3小时转化率为1.06 μmol/min，显著高于无细胞提取液的0.228 μmol/min。该策略利用亲脂性细胞作为酶载体克服了水/有机两相体系的传质限制和酶失活问题，同时通过TtADH以环己醇为底物实现NADH原位再生，构建了仅含底物和催化量NADH的简单无水反应体系，为水不溶性底物的高浓度、高对映选择性生物催化提供了可行方案。
创新点
1）分离并表征了来自Geobacillus sp. 30的新型耐热、耐有机溶剂的烯还原酶；2）利用R. opacus B-4的亲脂性细胞作为酶‘胶囊’将酶递送进有机介质，避免了水/有机两相体系的传质限制；3）采用TtADH以环己醇为底物进行NADH原位再生，构建了仅含底物和催化量NADH的简单无水反应体系；4）在无水条件下同时实现了高产物浓度（634 mM）和高对映选择性（89.2% ee）的(6R)-levodione生产。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Geobacillus sp. 30 | 酮异佛尔酮不对称还原为(6R)-levodione | ene reductase gene (AB900619) | NADH:flavin oxidoreductase (ene reductase) | 催化 | 新型耐热、耐有机溶剂的烯还原酶，属于old yellow enzyme家族，最适pH 8.0，最适温度70°C，对酮异佛尔酮还原产物ee为88.1% (R) |
| Thermus thermophilus HB8 | 环己醇氧化为环己酮（NADH再生） | TtADH gene (Type II 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase) | TtADH | 催化 | NAD+依赖的醇脱氢酶，用于辅因子再生，以环己醇为底物，在R. opacus中表达活性为16.7 mU/mg蛋白 |
| Rhodococcus opacus B-4 | 无水有机介质中的全细胞生物转化 | 烯还原酶基因 + TtADH基因（共表达） | 烯还原酶 + TtADH | 催化 | 亲脂性细胞作为酶胶囊，直接分散在环己醇/酮异佛尔酮混合液中，50°C反应24小时产634 mM (6R)-levodione，ee 89.2%，细胞在反应条件下不存活但酶保持活性 |
关键发现
- 从Geobacillus sp. 30中纯化得到新型烯还原酶，纯化39倍，总收率3.0%
- 亚基分子量37.9 kDa，天然分子量约114 kDa（推测为三或四聚体）。重组酶在E. coli中表达后经热处理和色谱纯化，纯化56.7倍，收率65.2%。酶最适pH为8.0，最适温度为70°C
- 在50°C下8小时保留>75%活性，在20%（v/v）有机溶剂中12小时保留>60%活性，在80%乙醇中25°C处理5分钟保留>85%活性。对酮异佛尔酮的Km=2.38 mM，kcat=6.42 s^-1，kcat/Km=2.70 s^-1 mM^-1
- 对NADPH和NADH的Km分别为0.0259和0.0273 mM。还原2-甲基-2-环己烯-1-酮产物的对映体过量（ee）为96.0%（R），还原酮异佛尔酮的ee为88.1%（R）。筛选出TtADH（Type II 3-羟基酰基-CoA脱氢酶），在R. opacus中表达活性为16.7 mU/mg蛋白。共表达重组R. opacus的烯还原酶和TtADH活性分别为113和16.7 mU/mg蛋白。将700 mg湿细胞直接悬浮在1.0 M酮异佛尔酮（溶于环己醇）中，50°C反应24小时，产生634 mM (6R)-levodione，ee为89.2%，初始3小时转化率为1.06 μmol/min（无细胞提取液为0.228 μmol/min）
- NADH转化数为53。在水相单相反应中，细胞提取液活性是整细胞的3.3倍（35.0 vs 10.6 μmol/min）。重组细胞在反应条件下不存活（无菌落形成）。
研究结论
将嗜热酶与亲脂性细菌细胞（R. opacus B-4）相结合，能够在无水有机介质中实现水不溶性化学品的高效生物催化转化。该策略克服了传统水/有机两相体系中底物传质限制和有机溶剂对酶的失活问题，同时避免了水相中产物的消旋化，可实现高浓度、高对映选择性的产物合成。