Enhancement of glycerol utilization ability of Ralstonia eutropha H16 for production of polyhydroxyalkanoates
- 作者
- Toshiaki Fukui, Masaharu Mukoyama, Izumi Orita, Satoshi Nakamura
- 单位
- Department of Bioengineering, Graduate School of Bioscience and Biotechnology, Tokyo Institute of Technology; Strategic Technology Research Center, NIPPON SHOKUBAI
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2014）
- DOI
- 10.1007/s00253-014-5831-3
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
野生型Ralstonia eutropha H16在甘油上生长极慢，难以利用廉价甘油高效生产聚羟基脂肪酸酯（PHA），需要增强其甘油同化能力。
研究策略
将大肠杆菌的甘油转运蛋白基因glpF和甘油激酶基因glpK（单独或组合）通过同源重组整合到H16染色体上（位于h16_A2858上游），评估对甘油利用和PHA生产的影响。
核心内容
该研究针对野生型Ralstonia eutropha H16难以高效利用廉价甘油生产聚羟基脂肪酸酯（PHA）的问题，通过同源重组将大肠杆菌甘油激酶基因glpK及甘油转运蛋白基因glpF单独或组合整合至H16染色体上，构建工程菌株。结果显示，仅弱表达glpK即可显著增强甘油同化能力，无需外源转运蛋白：H16_glpK与H16_glpFK在甘油上的比生长速率达0.15 h⁻¹，72小时产P(3HB) 1.3~1.4 g/L（产率0.27~0.29 g/g），而野生型需268小时仅产1.08 g/L。工程菌以甘油合成的P(3HB)分子量不下降，多分散性指数从野生型的3.2降至2.4。此外，H16_glpFK在大豆油上产P(3HB)达3.64 g/L，较野生型提高约17%；引入PHA合酶突变体后，NSDG_glpFK从甘油72小时产P(3HB) 1.53 g/L（含量68%）。该策略通过染色体整合实现甘油激酶的适度表达，使H16快速生长并高产高分子量PHA，为利用廉价甘油规模化生产生物基材料提供了有效平台。
创新点
发现仅弱表达甘油激酶基因glpK即可显著增强H16的甘油利用能力，无需外源甘油转运蛋白glpF；通过染色体整合避免了多拷贝质粒上glpK过表达引发的基因缺失；工程菌从甘油合成P(3HB)时分子量不下降且多分散性指数降低。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Ralstonia eutropha H16 | 甘油代谢 | glpK（大肠杆菌） | 甘油激酶 GlpK | 催化 | 弱表达即可显著增强甘油利用，是H16甘油生长受限的关键限制因素 |
| Ralstonia eutropha H16_glpFK | 甘油代谢 | glpF（大肠杆菌） | 水甘油通道蛋白 GlpF | 转运 | 非必需，但在大豆油培养时可能促进甘油摄取，产量提高至117% |
| Ralstonia eutropha H16 | 甘油代谢 | h16_A2507, h16_B1199 | 内源推定甘油激酶 | 催化 | 活性太弱，不足以支持H16在甘油上的快速生长 |
| Ralstonia eutropha H16 | 甘油代谢 | h16_A3690, ptsMHI | 内源甘油转运蛋白/磷酸转移酶系统 | 转运 | H16具有潜在的甘油摄取能力，但缺乏激酶活性是主要瓶颈 |
| Ralstonia eutropha H16 | PHA生物合成 | phaCRe | PHA合酶（PhaCRe） | 催化 | 催化P(3HB)聚合，甘油为底物时分子量无显著下降 |
| Ralstonia eutropha NSDG | PHA生物合成 | phaCNSDG | PHA合酶突变体（N143S/D171G） | 催化 | 来自Aeromonas caviae，用于合成P(3HB-co-3HHx)并提高甘油利用 |
| Ralstonia eutropha TT013 | PHA生物合成 | phaJAc, phaJ4Re | (R)-烯脂酰辅酶A水合酶 | 催化 | 参与3HHx单体供给，甘油代谢增强对共聚物组成影响小 |
关键发现
- H16_glpK和H16_glpFK在甘油上的比生长速率达0.15 h^-1（果糖为0.28 h^-1），72 h产P(3HB)
- 3~1.4 g/L（产率0.27~0.29 g/g），而野生型H16在268 h仅产1.08 g/L；H16_glpFK在大豆油上产P(3HB)
- 64 g/L（产率0.39 g/g），较H16提高约17%；H16_glpFK中甘油激酶活性为11.4 mU/mg（甘油培养48 h），仅略高于野生型在甘油206 h的6.0 mU/mg；H16_glpFK以甘油合成的P(3HB)数均分子量Mn=9.2×10^5、重均分子量Mw=22.5×10^5、PDI=2.4，而野生型H16的PDI为3.2；NSDG_glpFK从甘油72 h产P(3HB)
- 53 g/L（含量68.0%），亲本NSDG在268 h产1.22 g/L；NSDG_glpFK和TT013_glpFK从大豆油合成P(3HB-co-3HHx)的3HHx摩尔分数分别为1.7%和9.9%。
研究结论
通过染色体整合E. coli glpK（或glpFK）实现弱表达甘油激酶，即可使R. eutropha H16高效利用甘油快速生长并高产高分子量PHA，为利用廉价甘油作为生物基材料平台奠定了基础。