Bacterial production of isobutanol without expensive reagents
- 作者
- Hironaga Akita, Nobutaka Nakashima, Tamotsu Hoshino
- 单位
- Biomass Refinery Research Center, National Institute of Advanced Industrial Sciences and Technology (AIST); Bioproduction Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Sciences and Technology (AIST); Department of Biological Information, Graduate School of Bioscience and Biotechnology, Tokyo Institute of Technology
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2014）
- DOI
- 10.1007/s00253-014-6173-x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
现有微生物生产异丁醇的方法依赖昂贵试剂（如质粒、诱导剂）维持基因表达，不适用于工业化生产。
研究策略
利用BICES（生物质诱导型染色体表达系统），将异丁醇合成所需异源基因整合到大肠杆菌基因组，通过木糖诱导表达（木糖为木质纤维素生物质中常见糖），并利用mlc*突变解除碳代谢抑制，优化培养条件后实现低成本生产。
核心内容
该研究针对微生物生产异丁醇依赖质粒和诱导剂等昂贵试剂、难以工业化的问题，构建了基于生物质诱导型染色体表达系统（BICES）的大肠杆菌菌株mlcXT7-LAFC-AAKCD。研究将异丁醇合成所需的alsS、ilvC、ilvD、kivd和adhA等异源基因整合至基因组，利用木质纤维素生物质中常见的木糖诱导表达，并通过mlc*突变解除碳代谢抑制，实现葡萄糖与木糖的共利用。标准培养条件下，该菌株在不使用质粒和诱导剂时以葡萄糖和木糖为碳源发酵48小时产量达6.8 g/L；优化培养条件（32℃、pH 6.5、150 rpm）后产量提升至8.4 g/L，生产率和理论产率较标准条件提高1.2倍。以日本雪松水解液为碳源（不添加酵母提取物）发酵96小时产异丁醇3.7 g/L，生产率较先前报道的纤维素利用菌株高4.4倍，较使用质粒和诱导剂的以往研究高1.3倍。结果表明，BICES系统结合木糖诱导和碳代谢调控改造，可显著降低异丁醇生产成本，为利用木质纤维素水解液实现工业化生产提供了可行方案。
创新点
['无需质粒和诱导剂，降低生产成本和代谢负担', '利用木糖诱导表达系统，木糖存在于生物质水解液中', '通过mlc*突变解除碳代谢抑制，实现葡萄糖和木糖共利用', '基因组多基因整合并优化培养条件获得较高产量', '成功利用日本雪松水解液作为廉价原料生产异丁醇']
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| E. coli mlcXT7-LAFC-AAKCD | — | — | — | — | 底盘菌株，基于MG1655，敲除ldhA、adhE、pflB、ackA-pta，整合异丁醇合成基因 |
| E. coli mlcXT7-LAFC-AAKCD | 异丁醇生物合成途径 | alsS | α-乙酰乳酸合酶 | 催化 | 来自Bacillus subtilis，催化丙酮酸生成α-乙酰乳酸 |
| E. coli mlcXT7-LAFC-AAKCD | 异丁醇生物合成途径 | ilvC | 酮醇酸还原异构酶 | 催化 | 来自E. coli，催化α-乙酰乳酸还原异构化 |
| E. coli mlcXT7-LAFC-AAKCD | 异丁醇生物合成途径 | ilvD | 二羟酸脱水酶 | 催化 | 来自E. coli，催化二羟酸脱水生成α-酮异戊酸 |
| E. coli mlcXT7-LAFC-AAKCD | 异丁醇生物合成途径 | kivd | α-酮异戊酸脱羧酶 | 催化 | 来自Lactococcus lactis，催化α-酮异戊酸脱羧生成异丁醛 |
| E. coli mlcXT7-LAFC-AAKCD | 异丁醇生物合成途径 | adhA | 醇脱氢酶 | 催化 | 来自Lactococcus lactis，催化异丁醛还原为异丁醇 |
| E. coli mlcXT7-LAFC-AAKCD | 碳代谢调控 | mlc | Mlc负调控因子 | 调控 | mlc*突变解除碳分解代谢抑制，使PxyIF启动子在葡萄糖和木糖共存时仍能诱导表达 |
| E. coli mlcXT7-LAFC-AAKCD | 异丁醇生物合成途径 | T7RNAP | T7 RNA聚合酶 | 调控 | 受木糖诱导型PxyIF启动子控制，驱动Pr7启动子控制的外源基因表达 |
关键发现
- 构建的E. coli菌株mlcXT7-LAFC-AAKCD在无需质粒和诱导剂的条件下，以葡萄糖和木糖为碳源，标准条件培养48小时产异丁醇6.8 g/L
- 优化培养条件（32℃、pH 6.5、150 rpm）后，48小时产量达8.4 g/L，消耗葡萄糖25.6 g/L、木糖5.2 g/L，生产率0.175 g/L/h，与标准条件相比生产率和理论产率提高1.2倍。以日本雪松水解液为碳源（不添加酵母提取物），96小时产异丁醇3.7 g/L，消耗葡萄糖55.0 g/L、木糖7.6 g/L，生产率0.0385 g/L/h，比先前报道的纤维素利用菌株高4.4倍
- 与使用质粒和诱导剂的以往研究相比，本方法生产率提高1.3倍。
研究结论
本研究表明，利用BICES系统构建的E. coli菌株能够在不使用昂贵试剂的情况下，利用木质纤维素水解液高效生产异丁醇，具有工业应用潜力。