高级醇 · 代谢工程文献库

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Metabolic engineering of Propionibacterium freudenreichii: effect of expressing phosphoenolpyruvate carboxylase on propionic acid production

作者
Ehab Mohamed Ammar, Ying Jin, Zhongqiang Wang, Shang-Tian Yang
单位
William G. Lowrie Department of Chemical and Biomolecular Engineering, The Ohio State University
杂志
Applied Microbiology and Biotechnology（2014）
DOI
10.1007/s00253-014-5836-y
所属领域
代谢工程
关键词
CO2 fixationGlycerolPhosphoenolpyruvate carboxylasePropionibacteriaPropionibacterium freudenreichiiPropionic acid
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解决的核心问题

发酵法生产丙酸存在产率低和生产力低的问题，本研究旨在通过代谢工程手段提高丙酸产量。

研究策略

将大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)编码基因ppc克隆并异源表达于费氏丙酸杆菌中，增强CO2固定和草酰乙酸供给，从而改变二羧酸途径的碳通量分布。

研究路线图

100%
丙酸发酵产率与生产力低
异源表达ppc基因增强CO2固定
克隆ppc转入费氏丙酸杆菌DSM 20271
PPC酶活提高约50%（4.59 vs 3.12 U/mg）
甘油+CaCO3：丙酸13.1 g/L（+36%）
葡萄糖+CaCO3：丙酸14.9 g/L（+39%）
反应器+CO2加压：产率提升10.4%，P/A比+33%
结论：ppc表达增强二羧酸途径碳通量，促进生长与丙酸生产
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核心内容

该研究通过代谢工程改造费氏丙酸杆菌DSM 20271，将大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PPC）编码基因ppc异源表达于该菌株中，以增强CO2固定并促进草酰乙酸供给，从而调控二羧酸途径的碳通量，提高丙酸产量。结果显示，表达ppc后PPC比酶活达4.59±0.06 U/mg，较野生型提高约50%。以甘油为碳源时，突变株丙酸滴度达13.1 g/L，比野生型9.6 g/L提高36%，生产速率提高40%；在生物反应器pH 6.5条件下，丙酸生产率0.064 g/L·h，比野生型高68%，甘油消耗速率高173%。在约2 atm CO2加压条件下，丙酸与乙酸之比从2.47升至3.28，丙酸产率从0.46提高至0.51 g/g。此外，突变株对丙酸的耐受性也有所增强。研究表明异源表达ppc可有效强化丙酸杆菌的CO2固定和丙酸分支代谢，为通过二羧酸途径改造提升丙酸工业发酵性能提供了新策略。

创新点

['首次在丙酸杆菌中异源表达大肠杆菌ppc基因用于增强丙酸生产', '通过表达PPC绕过丙酮酸分支点，直接将磷酸烯醇式丙酮酸转化为草酰乙酸', '发现在高CO2分压下表达ppc可显著提高丙酸产量和产率']

研究对象（4）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Propionibacterium freudenreichii DSM 20271 丙酸生物合成（二羧酸途径） ppc 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PPC） 催化 异源表达来自大肠杆菌的ppc基因，催化PEP+CO2生成OAA
Escherichia coli str. K-12 substr. DH10B — ppc PPC 催化 提供ppc基因模板
Propionibacterium freudenreichii DSM 4902 丙酸生物合成 — — 催化 尝试转化pKHEM04-ppc获得菌落，但丙酸产量低于野生型，未被进一步研究
Propionibacterium acidipropionici ATCC 4875 丙酸生物合成 — — 催化 尝试转化但未获得转化子

关键发现

  1. ['在费氏丙酸杆菌DSM 20271中表达ppc后，PPC比酶活达到4.59±0.06 U/mg，比野生型(3.12±0.09 U/mg)提高约50%', '以甘油为碳源、有CaCO3缓冲时，突变株丙酸滴度达13.1 g/L，比野生型(9.6 g/L)提高36%，丙酸生产速率提高40%', '在无pH控制的血清瓶中，突变株比生长速率0.089±0.002 h-1，高于野生型0.078±0.003 h-1；最终OD达到4.7 vs
  2. 7', '在葡萄糖发酵有CaCO3时，突变株丙酸滴度14.9 g/L vs 野生型10.7 g/L，葡萄糖消耗速率0.142 vs
  3. 090 g/L·h', '在生物反应器pH6.5下以甘油为碳源时，突变株丙酸生产率0.064±0.006 g/L·h，比野生型(0.038±0.009 g/L·h)高68%，甘油消耗速率高173%', '在CO2加压(约2 atm)条件下，突变株P/A比从2.47提高到3.28(增加33%)，丙酸产率从0.46提高到0.51 g/g(增加10.4%)', '在含5 g/L丙酸条件下，突变株最终OD
  4. 5 vs 野生型1.9，耐受性有所提高']

研究结论

在费氏丙酸杆菌DSM 20271中表达大肠杆菌ppc基因可以增强CO2固定，增加从磷酸烯醇式丙酮酸到草酰乙酸的碳通量，促进细胞生长和丙酸生产，尤其以甘油为碳源时效果显著。这是首次通过异源表达ppc基因上调二羧酸途径丙酸分支进行代谢工程改造丙酸杆菌的报道。