Production of halophilic proteins using Haloferax volcanii H1895 in a stirred-tank bioreactor
- 作者
- Eva Strillinger, Stefan Wolfgang Grötzinger, Thorsten Allers, Jörg Eppinger, Dirk Weuster-Botz
- 单位
- Institute of Biochemical Engineering, Department of Mechanical Engineering, Technische Universität München, Munich, Germany; Division of Physical Sciences and Engineering, Biological & Organometallic Catalysis Laboratory, KAUST Catalysis Center (KCC), King Abdullah University of Science and Technology, Thuwal, Kingdom of Saudi Arabia; Computer, Electrical and Mathematical Sciences and Engineering division, Computational Bioscience Research Center (CBRC), King Abdullah University of Science and Technology, Thuwal, Kingdom of Saudi Arabia; Institute of Genetics, School of Biology, University of Nottingham, Queen's Medical Centre, Nottingham, UK
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2016）
- DOI
- 10.1007/s00253-015-7007-1
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
Haloferax volcanii因极易形成生物膜无法在搅拌槽生物反应器中培养，且嗜盐蛋白异源表达量低。本文旨在通过基因敲除获得不形成生物膜的菌株，并开发基于搅拌槽生物反应器的可控批量培养与诱导工艺，实现嗜盐蛋白的大规模高效生产。
研究策略
利用敲除鞭毛/菌毛组装相关基因（Hvo_1033和Hvo_1034）的H. volcanii H1895菌株消除生物膜问题；在搅拌槽反应器中系统优化培养基（补充酵母提取物、酪蛋白氨基酸、乳酸、铵盐和磷酸盐）以提高细胞密度；以嗜盐β-半乳糖苷酶bgaH为报告基因，在10 mL平行反应器中筛选L-色氨酸诱导浓度、诱导时机和孵育时间，建立两步诱导方案，并应用于两种红海热卤池来源的嗜盐醇脱氢酶ADH/D1和ADH/A1的表达、纯化和活性验证。
核心内容
该研究通过敲除鞭毛/菌毛组装相关基因Hvo_1033和Hvo_1034，获得了不形成生物膜的Haloferax volcanii H1895菌株，从而解决了该古菌无法在搅拌槽生物反应器中培养的瓶颈。在1 L搅拌槽反应器中，通过优化培养基组分（补充酵母提取物、酪蛋白氨基酸、乳酸、铵盐和磷酸盐），不表达重组蛋白时细胞干重可达10 g/L以上，为摇瓶培养的6倍。以嗜盐β-半乳糖苷酶bgaH为报告基因，建立了6 mM+3 mM的两步L-色氨酸诱导方案，比活最高达73 U/g CDW，优于单步诱导。应用该工艺表达两种红海热卤池来源的嗜盐醇脱氢酶ADH/D1和ADH/A1，最大细胞干重分别为6.5 g/L和5.3 g/L，纯化产量达16.8 mg/g CDW和3.9 mg/g CDW，总纯化蛋白分别达109 mg和20.6 mg，比摇瓶提高15倍和28倍；而大肠杆菌中完全未检测到这两种蛋白表达。结果表明，该方法可大幅提高嗜盐蛋白的异源表达水平，为嗜盐蛋白的规模化生产提供了可行的发酵工艺。
创新点
1）构建了不形成生物膜的Haloferax volcanii H1895菌株，使搅拌槽反应器培养成为可能；2）开发了补料优化的Hv-YPC培养基，使细胞干重达到10 g/L以上，是摇瓶培养的6倍；3）建立了6 mM+3 mM的两步L-色氨酸诱导方案，与摇瓶相比异源蛋白产量最高提高28倍。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Haloferax volcanii H1895 | 菌毛/鞭毛组装与生物膜形成 | Hvo_1033, Hvo_1034 | — | 调控 | 敲除后菌株不形成生物膜但仍保持运动能力，适用于搅拌槽反应器培养。 |
| Haloferax volcanii H1895 | 重组蛋白表达（p.tna调控） | bgaH | BGAH（β-半乳糖苷酶） | 催化 | 作为报告酶，用于筛选L-色氨酸诱导条件。 |
| Haloferax volcanii H1895 | 重组蛋白表达（p.tna调控） | ADH/D1 | ADH/D1（醇脱氢酶） | 催化 | 来自红海热卤池，在1 L反应器中纯化产量16.8 mg/g_CDW。 |
| Haloferax volcanii H1895 | 重组蛋白表达（p.tna调控） | ADH/A1 | ADH/A1（醇脱氢酶） | 催化 | 来自红海热卤池，在1 L反应器中纯化产量3.9 mg/g_CDW（摘要为3.2，正文结果与讨论为3.9）。 |
| Escherichia coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL | 重组蛋白表达（pET-3a） | ADH/D1, ADH/A1 | ADH/D1, ADH/A1 | 催化 | 尝试用E. coli表达两种ADH，但均未观察到重组表达。 |
| Haloferax volcanii H1424 | 重组蛋白表达（p.tna调控） | ADH/D1, ADH/A1 | ADH/D1, ADH/A1 | 催化 | 摇瓶中可表达，但在搅拌槽反应器中因严重生物膜无法继续培养。 |
| Haloferax volcanii H1895 | 基因表达调控 | p.tna（色氨酸酶启动子） | — | 调控 | 受L-色氨酸诱导的启动子，用于控制异源蛋白表达。 |
关键发现
- 不表达蛋白时，H. volcanii H1895在补充培养基中细胞干重达10 g/L（35 h后为10.5 g/L）
- 两种嗜盐醇脱氢酶在p.tna启动子控制下于1 L搅拌槽反应器中表达，最大细胞干重分别为6.5 g/L（ADH/D1）和5.3 g/L（ADH/A1），纯化产量分别为16.8 mg/g_CDW和3.9 mg/g_CDW（摘要中写3.2 mg/g_CDW，正文结果和讨论为3.9）
- 而在摇瓶中产量仅3.53 mg/g_CDW（ADH/D1）和0.44 mg/g_CDW（ADH/A1），细胞干重分别为2.1 g/L和1.7 g/L。从1 L反应器中获得总纯化蛋白109 mg（ADH/D1）和20.6 mg（ADH/A1），比摇瓶提高15倍和28倍。以BGAH为报告基因，两步诱导（6 mM L-色氨酸、16 h后加3 mM、再4 h）在10 mL反应器中获得最高比活73 U/g_CDW
- 单步诱导7 mM L-色氨酸时比活最高为23 U/g_CDW，但超过7 mM会因L-色氨酸毒性抑制表达。最佳总诱导时间为18~20 h。此外，E. coli-CodonPlus(DE3)-RIPL中完全未检测到ADH/D1和ADH/A1表达，而H. volcanii H1424在反应器中因严重生物膜无法使用。
研究结论
成功建立了基于Haloferax volcanii H1895的搅拌槽生物反应器分批培养工艺，通过敲除生物膜相关基因、优化培养基和两步L-色氨酸诱导方案，使细胞密度和异源蛋白产量大幅提高（最高28倍），并成功表达了两种具有活性的嗜热嗜盐醇脱氢酶，证明该方法适用于嗜盐蛋白的规模化生产。