Highly efficient biosynthesis of astaxanthin in Saccharomyces cerevisiae by integration and tuning of algal crtZ and bkt
- 作者
- Pingping Zhou, Lidan Ye, Wenping Xie, Xiaomei Lv, Hongwei Yu
- 单位
- Institute of Bioengineering, College of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University; Key Laboratory of Biomass Chemical Engineering of Ministry of Education, Zhejiang University
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2015）
- DOI
- 10.1007/s00253-015-6791-y
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在酿酒酵母中高效合成虾青素，克服β-胡萝卜素向虾青素转化步骤的瓶颈，实现虾青素的高产。
研究策略
将雨生红球藻的β-胡萝卜素羟化酶基因crtZ和酮化酶基因bkt导入β-胡萝卜素高产的酿酒酵母菌株，结合密码子优化、基因拷贝数调整和铁离子辅因子添加等策略，优化虾青素合成途径，并解析酶的底物特异性。
核心内容
这项研究通过整合雨生红球藻来源的β-胡萝卜素羟化酶基因crtZ和酮化酶基因bkt，在β-胡萝卜素高产的酿酒酵母菌株中成功构建了虾青素生物合成途径。研究采用了密码子优化、基因拷贝数调整和添加铁离子辅因子等组合策略，其中密码子优化使OcrZ和Obkt的表达量分别比野生型提高9.4倍和26.7倍，并最终将虾青素产量从初始菌株的0.385 mg/g DCW提升至4.7 mg/g DCW，这是当时酿酒酵母中报道的最高产量，比此前报道的首个产虾青素菌株高出约13倍。此外，底物特异性实验首次阐明了CrtZ与BKT催化虾青素合成的反应顺序：BKT优先将β-胡萝卜素转化为echinenone和canthaxanthin，CrtZ再将canthaxanthin转化为虾青素，因此推断最适合成路径为β-胡萝卜素→echinenone→canthaxanthin→虾青素。该研究不仅实现了虾青素在酿酒酵母中的高效异源合成，还验证了该宿主作为虾青素生产平台的潜力，为异源合成其他天然产物提供了可借鉴的方法学参考。
创新点
首次在酿酒酵母中整合雨生红球藻crtZ和bkt基因并实现虾青素合成；通过密码子优化显著提高异源基因表达水平；通过调整基因拷贝数和Fe2+添加实现虾青素产量最高达4.7 mg/g DCW；利用实验数据首次阐明H. pluvialis CrtZ和BKT催化虾青素合成的反应顺序。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 虾青素生物合成途径（β-胡萝卜素→虾青素） | crtZ | CrtZ（β-胡萝卜素羟化酶） | 催化 | 来自Haematococcus pluvialis，野生型及密码子优化型OcrZ，催化β-胡萝卜素或canthaxanthin的羟基化 |
| Saccharomyces cerevisiae | 虾青素生物合成途径（β-胡萝卜素→虾青素） | bkt | BKT（β-胡萝卜素酮化酶） | 催化 | 来自Haematococcus pluvialis，野生型及密码子优化型Obkt，催化β-胡萝卜素或echinenone的酮化 |
| Saccharomyces cerevisiae | β-胡萝卜素合成途径 | crtE, crtYB, crtI | CrtE、CrtYB、CrtI | 催化 | 来自Xanthophyllomyces dendrorhous，前期构建β-胡萝卜素高产菌株时引入 |
| Saccharomyces cerevisiae | 半乳糖调控系统 | GAL80 | Gal80p | 调控 | 删除GAL80以改造葡萄糖调控的GAL表达系统 |
| Saccharomyces cerevisiae | 半乳糖调控系统 | GAL4 | Gal4p | 调控 | 受葡萄糖供应调控，激活GAL1/GAL10启动子驱动类胡萝卜素基因表达 |
关键发现
- 初始菌株YPP1产虾青素0.385 mg/g DCW，β-胡萝卜素9.480 mg/g DCW
- 密码子优化后YPP7虾青素产量提高4倍至1.587 mg/g DCW，β-胡萝卜素降至4.807 mg/g DCW
- OcrZ表达量比野生型crtZ高9.4倍，Obkt比野生型bkt高26.7倍
- 增加OcrZ和Obkt拷贝数至各2个时YPP9虾青素产量达3.541 mg/g DCW，各3个时YPP13产量为4.203 mg/g DCW且虾青素占总类胡萝卜素50%
- 添加0.52 mM Fe2+后YPP9虾青素产量达4.7 mg/g DCW，为酿酒酵母中报道的最高值
- 与Ukibe等报道的首个产虾青素酿酒酵母菌株相比高出约13倍。底物特异性实验表明BKT优先将β-胡萝卜素转化为echinenone和canthaxanthin，CrtZ优先将canthaxanthin转化为astaxanthin，推断最适合成路径为β-胡萝卜素→echinenone→canthaxanthin→astaxanthin。
研究结论
通过组合策略在酿酒酵母中实现了目前报道的最高虾青素含量（4.7 mg/g DCW），证明了酿酒酵母作为虾青素生产宿主的潜力，并提供了异源合成天然产物的通用方法。