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Selective production of rubusoside from stevioside by using the sophorose activity of β-glucosidase from Streptomyces sp. GXT6

作者
Zilong Wang, Jinpei Wang, Minhua Jiang, Yutuo Wei, Hao Pang, Hang Wei, Ribo Huang, Liqin Du
单位
广西大学; 广西科学院
杂志
Applied Microbiology and Biotechnology（2015）
DOI
10.1007/s00253-015-6802-z
所属领域
酶工程 / 代谢工程
关键词
Rubus suavissimusRubusosideSophoroseSteviosideStreptomyces sp.β-Glucosidase
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解决的核心问题

如何高效、选择性水解甜菊苷（stevioside）C-13位槐糖基的β-1,2-糖苷键，从而制备高附加值甜味剂悬钩子苷（rubusoside），并避免过度水解产生多种副产物。

研究策略

从 Streptomyces sp. GXT6 基因组中筛选并克隆具有槐糖（sophorose）高亲和力的 β-葡萄糖苷酶基因 bgl1，在 E. coli 中异源表达、纯化，并系统研究其对甜菊苷的区域选择性水解活性。

研究路线图

100%
研究问题：如何高效选择性水解甜菊苷C-13槐糖基制备悬钩子苷？
策略：筛选并克隆bgl1基因，异源表达BGL1酶
关键改造：从Streptomyces sp.GXT6克隆bgl1基因（KJ958924）
关键改造：E.coli中异源表达、纯化BGL1（比活18.5 U/mg）
关键改造：优化水解条件（50°C, pH 8.5, 6h）
结果1：BGL1特异性水解C-13槐糖基，生成单一产物rubusoside
结果2：转化率98.2%，产率78.8%，单位酶产56.7 g/L/1000U/h
结果3：高槐糖亲和力（相对活性99.9%），高葡萄糖耐受（Ki 385 mM）
结论：BGL1是工业化生产悬钩子苷的理想候选酶
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核心内容

本研究从 Streptomyces sp. GXT6 基因组中克隆了 β-葡萄糖苷酶基因 bgl1，并在大肠杆菌中异源表达和纯化，获得重组酶 BGL1。该酶对槐糖底物表现出极高的底物特异性，相对活性达 99.9%。酶学性质研究表明，BGL1 对 pNPG 的最适 pH 为 6.5、最适温度 45°C，而对甜菊苷水解释放葡萄糖的最适条件为 pH 8.5、50°C。动力学参数显示其对甜菊苷的 Km 为 1.47 mM，kcat/Km 为 8.97 s⁻¹·mM⁻¹。关键发现是 BGL1 仅选择性水解甜菊苷 C-13 位槐糖基的 β-1,2-糖苷键，生成单一产物悬钩子苷，不继续水解产物，且对莱鲍迪苷 A 无活性。在优化条件下，10 g/L 甜菊苷与 30 μg/mL 酶反应 6 小时，转化率达 98.2%，悬钩子苷产率 78.8%，单位酶产量为 56.7 g/L/1000 U/h。该酶还表现出高葡萄糖耐受性（Ki 385 mM），在 45°C 以下具有较好的热稳定性。这些特性使 BGL1 成为工业化生产高附加值甜味剂悬钩子苷的理想酶制剂。

创新点

['首次报道来源于 Streptomyces sp. GXT6 的 β-葡萄糖苷酶 BGL1 能特异性水解甜菊苷 C-13 位槐糖基的葡萄糖基，而不水解 C-19 酯键及其他糖苷键，选择性生成单一产物 rubusoside。', 'BGL1 对槐糖的底物特异性极高（相对活性 99.9%），且分子量小、葡萄糖耐受性强（Ki 385 mM）。', '在 6 小时内即可完成水解，转化率 98.2%，rubusoside 产率 78.8%，单位酶产量显著高于已报道的其他酶。']

研究对象（5）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Escherichia coli XL1-Blue 甜菊苷水解生成悬钩子苷（rubusoside） bgl1 BGL1 催化 来源于 Streptomyces sp. GXT6 的 GH1 家族 β-葡萄糖苷酶，异源表达用于水解甜菊苷 C-13 位槐糖基，特异性生成 rubusoside。
Streptomyces sp. GXT6 槐糖代谢（天然底物为槐糖） bgl1 BGL1 催化 原始产酶菌株，基因组 GenBank 登录号 AYRX00000000；bgl1 基因登录号 KJ958924。
— 甜菊糖苷代谢 — — 催化 底物甜菊苷（stevioside），结构为 C-13位 β-槐糖基、C-19位 β-葡萄糖酯键。
— 甜菊糖苷代谢 — — 催化 产物悬钩子苷（rubusoside），C-13和C-19均为 β-葡萄糖，比甜菊苷少一个 C-13 槐糖基上的葡萄糖。
— 底物特异性分析 — — 催化 其他测试底物：槐糖、海带二糖、纤维二糖、龙胆二糖、苦杏仁苷、水杨苷、乳糖、pNPG、pNP-β-D-吡喃半乳糖苷等。

关键发现

  1. ['BGL1 对槐糖（sophorose）的相对活性为
  2. 9%，最适 pH
  3. 5（pNPG 底物），最适温度 45°C；对甜菊苷水解释放葡萄糖的最适 pH
  4. 5，最适温度 50°C。', 'BGL1 对 pNPG 的 Km 为
  5. 37 mM，kcat 为
  6. 36 1/s，kcat/Km 为
  7. 78 1/s·mM；对甜菊苷的 Km 为
  8. 47 mM，kcat 为
  9. 18 1/s，kcat/Km 为
  10. 97 1/s·mM。', 'BGL1 水解甜菊苷时只剪切 C-13 位 sophoroside 的葡萄糖基，产物为 rubusoside，且不继续水解 rubusoside；对 rebaudioside A 无活性，对 steviolbioside 水解产生 steviolmono-glucoside。', '在 50°C、pH
  11. 5 条件下，10 g/L 甜菊苷与 30 μg/mL BGL1 反应 6 小时，甜菊苷转化率
  12. 2%，rubusoside 产率
  13. 8%，单位酶产量为
  14. 7 g/L rubusoside/1000 U/h。', 'BGL1 半衰期在
  15. 40、45、50、55°C 下分别为
  16. 324、38、5.6、0.9 min。', 'BGL1 纯化后比活为
  17. 5 U/mg，纯化倍数为
  18. 6 倍，回收率
  19. 6%。']

研究结论

本研究鉴定并表征了来源于 Streptomyces sp. GXT6 的新型 β-葡萄糖苷酶 BGL1，该酶能够特异性地水解甜菊苷 C-13 位的槐糖基葡萄糖，高效生产 rubusoside（转化率 98.2%，产率 78.8%，6 h），且具有高葡萄糖耐受性和良好的工业应用潜力，是工业化生产悬钩子苷的理想候选酶。