ARTP mutation and genome shuffling of ABE fermentation symbiotic system for improvement of butanol production
- 作者
- Chunkai Gu, Genyu Wang, Shuai Mai, Pengfei Wu, Jianrong Wu, Gehua Wang, Hongjuan Liu, Jianan Zhang
- 单位
- Institute of Nuclear and New Energy Technology, Tsinghua University; The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2017）
- DOI
- 10.1007/s00253-017-8093-z
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
提高ABE发酵共生系统TSH06的丁醇产量，同时保持其微氧耐受性，以促进丁醇的大规模工业化生产。
研究策略
以共生系统TSH06为亲本，采用常压室温等离子体（ARTP）诱变构建突变文库，再经四轮基因组改组（genome shuffling）整合优良性状，并与蜡样芽孢杆菌TSH2重建共生系统，以保留微氧耐受能力；通过丁醇耐受性筛选和发酵评价获得高产菌株，并用实时定量PCR分析关键酶基因表达。
核心内容
为提高ABE发酵共生系统TSH06的丁醇产量并保持其微氧耐受性，该研究以丁醇产生菌与蜡样芽孢杆菌TSH2构成的共生系统为亲本，采用常压室温等离子体（ARTP）诱变构建突变文库，再经四轮基因组改组整合优良性状，并通过丁醇耐受性筛选和发酵评价获得高产菌株。最优突变株TS4-30的丁醇效价达15.63 g/L，较亲本TSH06的11.96 g/L提高约30%，总溶剂达20.43 g/L，丁醇得率由0.20 g/g提升至0.24 g/g。实时定量PCR分析显示，TS4-30在产酸相中酸生成基因（ack、pta、buk、ptb）mRNA水平低于亲本，而在产溶剂相中溶剂生成基因（thl、hbd、adhE、bdhA、bdhB）mRNA水平明显升高，其中ctf基因在产酸相显著上调，与低有机酸积累和高丁醇产量一致。结果表明，酸生成途径被抑制而溶剂生成途径被增强的基因表达协调变化是高产丁醇的分子基础，该策略为利用非严格厌氧操作改良工业菌株提供了有效途径。
创新点
首次将ARTP诱变与基因组改组技术应用于丁醇产生共生系统；利用共生系统的微氧耐受特性简化操作，无需全程严格厌氧；通过丁醇耐受性筛选有效富集高产突变体；揭示酸生成与溶剂生成相关基因表达的协调变化是高丁醇产量的分子基础。
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Clostridium acetobutylicum TSH1 (CGMCC 8071) | ABE发酵（丁醇合成） | ack | 乙酸激酶（Acetate kinase） | 催化 | 产酸相关基因，在TS4-30中表达下调 |
| Clostridium acetobutylicum TSH1 (CGMCC 8071) | ABE发酵（丁醇合成） | pta | 磷酸转乙酰酶（Phosphate acetyltransferase） | 催化 | 产酸相关基因，在TS4-30中表达下调 |
| Clostridium acetobutylicum TSH1 (CGMCC 8071) | ABE发酵（丁醇合成） | buk | 丁酸激酶（Butyrate kinase） | 催化 | 产酸相关基因，在TS4-30中表达下调 |
| Clostridium acetobutylicum TSH1 (CGMCC 8071) | ABE发酵（丁醇合成） | ptb | 磷酸转丁酰酶（Phosphate butyryltransferase） | 催化 | 产酸相关基因，在TS4-30中表达下调 |
| Clostridium acetobutylicum TSH1 (CGMCC 8071) | ABE发酵（丁醇合成） | ctf | CoA转移酶（CoA-transferase） | 催化 | 酸再同化酶基因，在产酸相TS4-30中表达显著高于TSH06 |
| Clostridium acetobutylicum TSH1 (CGMCC 8071) | ABE发酵（丁醇合成） | thl | 乙酰-CoA乙酰转移酶（Acetyl-CoA acetyltransferase/thiolase） | 催化 | 在产溶剂相TS4-30中表达上调 |
| Clostridium acetobutylicum TSH1 (CGMCC 8071) | ABE发酵（丁醇合成） | hbd | 3-羟基丁酰-CoA脱氢酶（3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase） | 催化 | BCS操纵子基因，在产溶剂相TS4-30中表达上调 |
| Clostridium acetobutylicum TSH1 (CGMCC 8071) | ABE发酵（丁醇合成） | adhE | 乙醛-CoA/醇脱氢酶（Acetaldehyde-CoA/alcohol dehydrogenase） | 催化 | 溶剂生成关键基因，在TS4-30中表达上调 |
| Clostridium acetobutylicum TSH1 (CGMCC 8071) | ABE发酵（丁醇合成） | bdhA | NADH依赖性丁醇脱氢酶A（NADH-dependent butanol dehydrogenase A） | 催化 | 溶剂生成基因，在TS4-30中表达上调 |
| Clostridium acetobutylicum TSH1 (CGMCC 8071) | ABE发酵（丁醇合成） | bdhB | NADH依赖性醇脱氢酶B（NADH-dependent alcohol dehydrogenase B） | 催化 | 溶剂生成基因，在TS4-30中表达上调 |
| Bacillus cereus TSH2 (CGMCC 8072) | 共生系统耗氧 | — | — | 能量供给 | 兼性厌氧菌，消耗氧气为严格厌氧的C. acetobutylicum TSH1创造厌氧环境，不产丁醇，不消耗葡萄糖 |
关键发现
- 最优突变株TS4-30的丁醇效价达15.63 g/L，较亲本TSH06（11.96 g/L）提高30%（摘要中为34%，对比12.19 g/L）；总溶剂（ABE）达20.43 g/L vs
- 3 g/L；葡萄糖消耗64.8 g/L vs
- 8 g/L；丁醇得率0.24 g/g vs
- 20 g/g。ARTP突变株A0-1和A0-2丁醇效价分别为13.42和13.67 g/L，较TSH06（12.60 g/L）提高6.5%和8.6%。基因表达分析显示，TS4-30在产酸相酸生成基因（ack、pta、buk、ptb）mRNA水平低于TSH06，而产溶剂相溶剂生成基因（thl、hbd、adhE、bdhA、bdhB）mRNA水平高于TSH06；其中ctf基因在产酸相显著上调，与低有机酸水平和高丁醇产量一致。
研究结论
通过ARTP诱变和四轮基因组改组，成功获得丁醇产量显著提高且保持微氧耐受的共生系统TS4-30。其高产机制与酸生成途径被抑制、溶剂生成途径被增强的基因表达模式有关。该研究为利用非厌氧操作进行菌种改良提供了有效策略。