Heterologous synthesis of geranyllinalool, a diterpenol plant product, in the cyanobacterium Synechocystis
- 作者
- Cinzia Formighieri, Anastasios Melis
- 单位
- Plant and Microbial Biology, University of California, 111 Koshland Hall, Berkeley, CA 94720-3102, USA
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2017）
- DOI
- 10.1007/s00253-016-8081-8
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在蓝细菌集胞藻中异源合成植物来源的二萜醇香叶基芳樟醇（geranyllinalool），并评估产物产量、胞内外分布及对宿主细胞生长的影响。
研究策略
将烟草（Nicotiana attenuata）的香叶基芳樟醇合酶（NaGLS）基因与内源藻蓝蛋白β亚基（cpcB）融合，在cpc操纵子启动子控制下通过同源重组整合到集胞藻基因组，利用内源MEP途径的GGPP合成目标产物，并通过气液两相反应器收集漂浮产物和破胞提取胞内产物。
核心内容
本研究在蓝细菌集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803中异源合成了植物来源的二萜醇香叶基芳樟醇。研究者将烟草香叶基芳樟醇合酶基因NaGLS与内源藻蓝蛋白β亚基基因cpcB融合，置于cpc操纵子启动子控制下，通过同源重组整合至基因组，利用宿主内源MEP途径的GGPP合成目标产物。在50 μmol photons m-2 s-1光照下培养48小时，三个转化子的总产量平均为360 μg/g干重，其中60–70%滞留胞内，其余漂浮于培养液表面。提高光照至180 μmol photons m-2 s-1后产量降至150 μg/g干重。融合蛋白CpcB·NaGLS约为118 kDa，产物经GC-MS确认。实验还发现，目标产物积累使细胞倍增时间延长约1.4倍，对生长造成一定抑制。该工作首次证明蓝细菌可稳定工程化生产植物二萜醇，但产物主要滞留胞内且带来代谢负担，后续需解决产物外排与毒性缓解问题。
创新点
['首次在蓝细菌中实现二萜醇（geranyllinalool）的异源合成', '利用CpcB融合表达策略大幅提高重组酶蛋白积累量，克服萜烯合酶低Kcat对产率的限制', '系统表征了二萜醇产物在胞内和胞外的分布，发现其主要滞留胞内（60-70%），部分漂浮在培养液表面', '评估了胞内累积产物对细胞生长、叶绿素含量和光学特性的影响']
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Synechocystis sp. PCC 6803 | MEP途径（萜类生物合成） | NaGLS | CpcB-NaGLS融合蛋白 | 催化 | 来自Nicotiana attenuata的geranyllinalool合酶，与藻蓝蛋白β亚基融合表达，催化GGPP转化为geranyllinalool |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 藻胆体/光捕获 | cpcB | 藻蓝蛋白β亚基（CpcB） | 调控 | 作为融合标签，利用其内源高丰度促进重组蛋白积累，同时敲除cpcB导致藻胆体天线截短 |
关键发现
- 在50 μmol photons m-2 s-1光照下48小时，集胞藻转化子总geranyllinalool平均产量为360 μg/g干重（三个独立转化子分别为390±78、381±86、288±78 μg/g dcw），其中60-70%为胞内产物（233 μg/g dcw），30-40%为漂浮产物（120 μg/g dcw）
- 180 μmol photons m-2 s-1光照下总产量降至150 μg/g dcw（分别为229±52、117±46、108±13 μg/g dcw）。NaGLS转化子细胞倍增时间在50和180 μmol photons m-2 s-1下分别为61.9±9.5 h和38.1±4.3 h，比LaPHLS对照（41.1±5.2 h和29.1±1.1 h）长约1.4倍。CpcB·NaGLS融合蛋白大小约118 kDa，通过SDS-PAGE和Western blot确认。GC-FID和GC-MS证实产物为geranyllinalool（保留时间22.6 min，MS特征离子69、81、93、107、290）。
研究结论
集胞藻可被稳定工程化以异源生产植物二萜醇geranyllinalool，但该产物主要滞留在胞内（60-70%），需破胞提取，且对细胞生长有轻微抑制（细胞倍增时间延长1.4倍）。与单萜烃类自发分泌不同，二萜醇的积累对宿主造成一定负担。研究为蓝细菌生产萜醇类产品提供了可行性证明，同时指出了需要解决产物外排和减轻毒性效应的挑战。