Molecular characterization of the actin-encoding gene and the use of its promoter for a dominant selection system in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha
- 作者
- H.A. Kang, W.-K. Hong, J.-H. Sohn, E.-S. Choi, S.K. Rhee
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2001）
- DOI
- 10.1007/s002530100605
- 所属领域
- 发酵工程
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解决的核心问题
Hansenula polymorpha作为工业重组蛋白生产菌株，缺乏合适的显性选择标记和可控拷贝数整合系统，本文旨在开发基于潮霉素B抗性的剂量依赖性选择系统。
研究策略
克隆并表征H. polymorpha的肌动蛋白基因（HpACT），分析其启动子结构，利用启动子驱动潮霉素B抗性基因（hph）表达，并通过启动子截短优化选择性能。
核心内容
该研究对甲基营养型酵母Hansenula polymorpha的肌动蛋白基因（HpACT）进行了分子表征，并基于其启动子构建了潮霉素B抗性的显性选择系统。HpACT编码376个氨基酸，与酿酒酵母肌动蛋白同源性达94.6%，基因全长约1.6 kb，含两个内含子，且能在酿酒酵母中正确剪接。启动子区域包含两个CCAAT盒和两个TATA样序列。研究使用853 bp的完整启动子驱动潮霉素抗性基因hph表达，转化频率约为1×10³/μg DNA（LEU⁺对照为2×10³），并发现随着潮霉素B浓度从0.25 g/L升至4 g/L，整合拷贝数可增至10。将启动子截短至150 bp去除上游TATA样序列后，在2 g/L潮霉素B条件下筛选所得转化子拷贝数约25，比完整启动子在4 g/L下高约2倍。该结果意味着通过调整启动子长度和抗生素浓度，可实现拷贝数的剂量依赖性调控，为H. polymorpha的遗传操作及重组蛋白生产中可控拷贝数整合提供了实用工具。
创新点
1. 首次报道H. polymorpha含有两个内含子的肌动蛋白基因；2. 利用HpACT启动子构建潮霉素B抗性选择系统，通过删除上游TATA样序列提高了对高拷贝转化子的选择性，实现拷贝数可控整合。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Hansenula polymorpha | — | ACT | actin | 调控 | 克隆并表征其基因结构，利用其启动子驱动hph表达 |
| Hansenula polymorpha | — | hph | hygromycin B phosphotransferase | 催化 | 来自大肠杆菌，赋予潮霉素B抗性 |
| Hansenula polymorpha | — | HLEU2 | — | 催化 | 作为亮氨酸选择标记，用于筛选转化子 |
| Saccharomyces cerevisiae | — | ACT (HpACT) | actin | 调控 | 用于验证HpACT内含子在异源宿主中的剪接 |
关键发现
- HpACT编码376个氨基酸，与S. cerevisiae肌动蛋白有94.6%同一性
- 基因长约1.6 kb，含两个内含子（352 bp和87 bp）
- 在S. cerevisiae中能正确剪接。启动子区域含两个CCAAT（-264和-137）和两个TATA样序列（-201和-80）。使用853 bp启动子驱动hph基因时，转化子直接获得潮霉素B抗性，转化频率约1×10^3/μg DNA（LEU+为2×10^3）
- 随潮霉素B浓度从0.25 g/L增至4 g/L，整合拷贝数增加至10。截短启动子至150 bp（去除上游TATA）后，在2 g/L潮霉素B下筛选到的转化子拷贝数约25，比完整启动子在4 g/L下的拷贝数高约2倍。
研究结论
HpACT基因结构被表征，其启动子可用于构建剂量依赖的潮霉素B抗性选择系统，通过调整抗生素浓度可方便地筛选不同拷贝数的转化子，为H. polymorpha的遗传操作和重组蛋白生产提供了有力工具。