高级醇 · 代谢工程文献库

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Bioconversion of limonene to increased concentrations of perillic acid by Pseudomonas putida GS1 in a fed-batch reactor

作者
A.E. Mars, J.P.L. Gorissen, I. van den Beld, G. Eggink
单位
Department of Bioconversion, Agrotechnological Research Institute (ATO), Wageningen University and Research Centre, PO Box 17, 6700 AA Wageningen, The Netherlands
杂志
Applied Microbiology and Biotechnology（2001）
DOI
10.1007/s002530100625
所属领域
发酵工程
关键词
恶臭假单胞菌柠檬烯生物转化紫苏酸补料分批培养
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解决的核心问题

提高 Pseudomonas putida GS1 将柠檬烯生物转化为紫苏酸的产量，解决批量培养中紫苏酸浓度有限（约18 mM）的问题。

研究策略

采用补料分批生物反应器，在非限制性生长条件下（甘油、铵离子和柠檬烯过量）培养 P. putida GS1，通过恒定补加甘油并控制 pH 和溶解氧，延长生产时间，从而将紫苏酸浓度提升至 64 mM；同时利用分子生物学方法鉴定催化柠檬烯转化的酶属于 p-cymene 降解途径。

研究路线图

100%
研究问题：
柠檬烯转化紫苏酸
产量低（~18 mM）
策略：
补料分批反应器
非限制性生长条件
关键改造1：
恒定补加甘油
控制pH与溶解氧
关键改造2：
比较GS1/F1/E.coli
确认最优菌株
关键改造3：
鉴定p-cymene途径
催化酶活性
结果1：
紫苏酸达64 mM (11 g/l)
产量提升3.5倍
结果2：
比生产速率1.1 mmol/g蛋白/h
前2天高效转化
结果3：
脱氢酶活性0.63 U/mg
证实cym途径参与
结论：
GS1为最优催化剂
产物单一可萃取纯化
具商业应用前景
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核心内容

该研究针对恶臭假单胞菌GS1在批量培养中转化柠檬烯为紫苏酸产量受限（约18 mM）的问题，采用补料分批反应器策略，在甘油、铵离子和柠檬烯均过量的非限制性生长条件下培养菌株，通过恒定补加甘油并控制pH和溶解氧延长生产时间，最终将紫苏酸浓度提升至64 mM（11 g/l），前两天的比生产速率达到1.1 mmol紫苏酸/g蛋白/h。研究还通过分子生物学方法鉴定出催化该转化的是p-cymene降解途径中的酶，perillyl alcohol和perillyl aldehyde脱氢酶在柠檬烯诱导下活性分别为0.47和0.14 U/mg蛋白，而无诱导物时低于0.02 U/mg，同时比较了GS1、F1及重组大肠杆菌三种菌株，确认GS1产酸能力最优。11 g/l的紫苏酸虽明显抑制生长，但菌株仍保持一定转化能力且产物为单一稳定化合物，便于萃取纯化，该补料分批策略显著提升了生物转化效率，具备商业应用潜力。

创新点

通过补料分批策略将紫苏酸产量从 18 mM 提高至 64 mM（11 g/l）；首次证明 P. putida GS1 中 p-cymene 降解途径的酶负责柠檬烯的共代谢转化；比较了三种菌株（GS1、F1 和重组 E. coli）的产酸能力，确认 GS1 最优。

研究对象（3）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Pseudomonas putida GS1 p-cymene 降解途径（cym 途径） cymAb, cmtC p-cymene 单加氧酶、perillyl alcohol 脱氢酶、perillyl aldehyde 脱氢酶 催化 野生型菌株，在补料分批培养中可将柠檬烯转化为紫苏酸，终浓度达 64 mM（11 g/l）
Pseudomonas putida F1 p-cymene 降解途径（cym 途径） cym 途径基因（与 GS1 同源） p-cymene 单加氧酶、perillyl alcohol 脱氢酶、perillyl aldehyde 脱氢酶 催化 也能将柠檬烯转化为紫苏酸，批量培养中最高约 9 mM，低于 GS1
Escherichia coli JM109(pRE847) p-cymene 降解途径（p-cymene 至 p-cumate 部分） pRE847 质粒上的 cym 基因（来自 P. putida F1） p-cymene 单加氧酶及脱氢酶 催化 重组菌，在 LB 培养基中紫苏酸最高约 7.9 mM（0.8% 柠檬烯）

关键发现

  1. 在补料分批反应器中，P. putida GS1 在非限制性甘油、铵和柠檬烯条件下，紫苏酸最终浓度达 64 mM（11 g/l）；前 2 天比生产速率为
  2. 1 mmol 紫苏酸/g 蛋白/h；批量培养中，初始添加 15 mM 紫苏酸时仍能生产，但速率和总产量降低；在 p-cymene 存在下，perillyl alcohol 和 perillyl aldehyde 脱氢酶活性分别为
  3. 63 和
  4. 24 U/mg 蛋白，在柠檬烯存在下为
  5. 47 和
  6. 14 U/mg，无诱导物时低于
  7. 02 U/mg；P. putida F1 在批量培养中约产 5 mM，后升至 9 mM，GS1 则从 9 mM 升至 14 mM；重组 E. coli JM109(pRE847) 在 LB 培养基中最高产
  8. 9 mM 紫苏酸（0.8% 柠檬烯时）；11 g/l 紫苏酸明显抑制生长，但仍有一定转化能力。

研究结论

在非限制性生长条件下，通过补料分批培养，P. putida GS1 可将柠檬烯转化为紫苏酸，终浓度高达 64 mM（11 g/l），且紫苏酸为单一稳定产物，可通过简单萃取纯化，具有商业应用前景。该转化由 p-cymene 降解途径的酶催化，P. putida GS1 是三者中最优的生物催化剂。