Xylose utilisation by recombinant strains of Saccharomyces cerevisiae on different carbon sources
- 作者
- W. H. van Zyl, A. Eliasson, T. Hobley, B. Hahn-Hägerdal
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（1999）
- DOI
- 10.1007/s002530051599
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）不能利用木糖，需要构建重组菌株并研究不同碳源共底物对木糖利用的影响
研究策略
通过同源重组将染色体FUR1基因替换为fur1::LEU2，构建自选择重组酿酒酵母菌株，表达Pichia stipitis的XYL1和XYL2基因，比较在确定/复杂培养基及葡萄糖/棉子糖共底物下的木糖消耗和产物形成
核心内容
该研究通过同源重组将酿酒酵母染色体上的FUR1基因替换为fur1::LEU2，构建了无需外加选择压力即可稳定维持重组质粒的自选择菌株，并在其中表达了来自树干毕赤酵母的XYL1和XYL2基因，使酿酒酵母获得木糖代谢能力。研究系统比较了确定培养基与复杂培养基，以及葡萄糖和棉子糖作为共底物对木糖利用的影响。结果显示，复杂培养基中木糖消耗速率达0.41 g L⁻¹ h⁻¹，是确定培养基（0.15 g L⁻¹ h⁻¹）的两倍以上；加入20 g/L共底物后，木糖消耗速率进一步提升至1.32（葡萄糖）和1.46（棉子糖）g/L/h，约为单独木糖（0.44 g/L/h）的三倍。82 h时，棉子糖共底物下木糖消耗达85%，高于葡萄糖的71%。以葡萄糖为共底物时前4 h乙醇迅速积累至9.6 g/L后降至5.5 g/L，并伴随甘油和乙酸生成；而以棉子糖为共底物时乙醇缓慢升至4.9 g/L且无副产物积累。这表明棉子糖能避免葡萄糖抑制效应，是更优的共底物选择，为优化重组酵母的木糖发酵提供了重要策略。
创新点
1. 构建了基于FUR1基因敲除的自选择系统，使重组质粒无需额外选择压力即可稳定维持；2. 首次系统比较葡萄糖与棉子糖作为共底物对重组菌木糖利用的影响，发现棉子糖可避免葡萄糖抑制并减少副产物
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae H158 (GPY55-15Bα) | 木糖代谢 | XYL1 | 木糖还原酶（xylose reductase） | 催化 | 来自Pichia stipitis，由ADH1启动子驱动表达 |
| Saccharomyces cerevisiae H158 (GPY55-15Bα) | 木糖代谢 | XYL2 | 木糖醇脱氢酶（xylitol dehydrogenase） | 催化 | 来自Pichia stipitis，由PGK1启动子驱动表达 |
| Saccharomyces cerevisiae H158 | 嘧啶代谢 | FUR1 | 尿嘧啶磷酸核糖转移酶 | 催化 | 染色体FUR1被替换为fur1::LEU2，构建自选择菌株 |
| Saccharomyces cerevisiae H158 | 己糖转运 | HXT2, HXT4, HXT6 | 高亲和力己糖转运蛋白 | 转运 | 在棉子糖慢速释放果糖时不引发葡萄糖抑制，并促进木糖摄取 |
关键发现
- 在复杂培养基中木糖消耗速率（0.41 g L⁻¹ h⁻¹）比确定培养基（0.15 g L⁻¹ h⁻¹）高两倍以上
- 加入20 g/L葡萄糖或棉子糖作为共底物后，木糖消耗速率进一步提高至1.32和1.46 g/L/h，约为单独使用木糖（0.44 g/L/h）的三倍。82 h后，以棉子糖为共底物时木糖消耗达85%，高于葡萄糖的71%
- 木糖醇产量分别为57%和43%，但木糖同化均为27%。以葡萄糖为共底物时，前4 h乙醇迅速积累至9.6 g/L，最终降至5.5 g/L，并伴随甘油和乙酸生成
- 以棉子糖为共底物时，乙醇从4 h的1.5 g/L逐步升至82 h的4.9 g/L，且无甘油、乙酸生成。在确定培养基中，80 g/L木糖发酵76 h仅消耗15%，其中8%转化为木糖醇、4%转化为木酮糖、3%被同化
- 而在复杂培养基中消耗39%，其中26%转化为木糖醇、13%被同化。
研究结论
复杂培养基和棉子糖作为共底物能显著提高重组酿酒酵母的木糖利用效率，棉子糖避免了葡萄糖的抑制效应和副产物积累，是研究木糖代谢和优化乙醇生产的更优共底物。