Discerning picroside-I biosynthesis via molecular dissection of in vitro shoot regeneration in Picrorhiza kurroa

作者: Neha Sharma, Rajinder Singh Chauhan, Hemant Sood
单位: Department of Biotechnology and Bioinformatics, Jaypee University of Information Technology, Waknaghat, Solan 173234, HP, India
杂志: Plant Cell Reports（2017）
DOI: 10.1007/s00299-016-1976-0
所属领域: 代谢工程
关键词: Gene expressionMorphogenetic stagesPicrorhiza kurroaPicrorhiza scrophulariifloraPicroside-IPrimary metabolismSecondary metabolism
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解决的核心问题

解析胡黄连（Picrorhiza kurroa）中picroside-I（P-I）生物合成的发育调控机制，识别不同形态发生阶段中参与P-I合成的关键基因，并探究温度、外植体和物种差异对P-I积累的影响。

研究策略

采用体外芽再生体系，将植物段（PS）、愈伤起始（CI）、愈伤组织（CM）、芽原基（SP）、多芽（MS）和完全发育（FD）六个形态发生阶段与P-I含量及初级/次级代谢通路基因表达进行关联分析，利用qRT-PCR检测21个基因的转录水平，并通过HPLC测定P-I含量，同时设置不同温度和植物比较实验。

研究路线图

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核心内容

该研究通过体外芽再生体系系统解析了胡黄连中picroside-I生物合成的发育调控机制。研究者将植物段、愈伤起始、愈伤组织、芽原基、多芽和完全发育六个形态发生阶段与P-I含量及21个初级/次级代谢通路基因的表达进行关联分析，利用HPLC测定P-I含量、qRT-PCR检测基因转录水平，并设置不同温度和物种比较实验。结果显示，P-I含量在脱分化阶段从2.51 μg/mg降至不可检测水平，在再分化阶段逐渐回升，完全发育阶段由叶段和根段在15℃下分别达3.65和2.87 μg/mg。在完全发育阶段，HMGR、PMK、DXPS、GS、G10H、DAHPS和PAL七个基因在15℃相对25℃高表达32至87倍，多芽阶段中HMGR、DXPS、ISPE、G10H、DAHPS较愈伤组织阶段上调15至52倍；与P. scrophulariiflora相比，这七个基因在完全发育阶段高表达6至19倍，与P-I含量一致。研究表明P-I生物合成受发育阶段严格调控，上述基因是参与P-I合成的关键酶基因，P. kurroa更适合作为代谢工程改造的靶标。

创新点

首次在分子水平对P. kurroa和P. scrophulariiflora的P-I生物合成进行比较；系统绘制了P. kurroa不同发育阶段初级和次级代谢基因的表达图谱，揭示P-I生物合成的发育调控特性。

研究对象（21）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Picrorhiza kurroa（胡黄连）组织培养细胞	MVA（甲羟戊酸）途径	HMGR	3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase	催化	MVA途径限速酶，在FD阶段高表达，与P-I积累正相关
Picrorhiza kurroa（胡黄连）组织培养细胞	MVA（甲羟戊酸）途径	PMK	Phosphomevalonate kinase	催化	FD阶段在15℃表达显著上调
Picrorhiza kurroa（胡黄连）组织培养细胞	MEP（非甲羟戊酸）途径	DXPS	1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase	催化	MEP途径限速酶，FD阶段高表达
Picrorhiza kurroa（胡黄连）组织培养细胞	MEP（非甲羟戊酸）途径	ISPD	2-C-methylerythritol 4-phosphate cytidyl transferase	催化	参与MEP途径，表达变化不显著
Picrorhiza kurroa（胡黄连）组织培养细胞	MEP（非甲羟戊酸）途径	ISPE	4-(Cytidine-5-diphospho)-2-C-methylerythritol kinase	催化	在SP和MS阶段表达上调
Picrorhiza kurroa（胡黄连）组织培养细胞	Iridoid（环烯醚萜）途径	GS	Geraniol synthase	催化	FD阶段高表达，参与单萜分支
Picrorhiza kurroa（胡黄连）组织培养细胞	Iridoid（环烯醚萜）途径	G10H	Geraniol-10-hydroxylase	催化	FD阶段高表达（15℃比25℃高77倍）
Picrorhiza kurroa（胡黄连）组织培养细胞	Iridoid（环烯醚萜）途径	10-HGO	10-Hydroxygeraniol dehydrogenase	催化	参与P-I生物合成，但表达变化未详细展示
Picrorhiza kurroa（胡黄连）组织培养细胞	Iridoid（环烯醚萜）途径	IS	Iridoid synthase	催化	参与环烯醚萜骨架形成
Picrorhiza kurroa（胡黄连）组织培养细胞	Shikimate/苯丙烷途径	DAHPS	3-Deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate synthase	催化	SP阶段表达上调28倍，FD阶段高表达
Picrorhiza kurroa（胡黄连）组织培养细胞	Shikimate/苯丙烷途径	PAL	Phenylalanine ammonia lyase	催化	FD阶段高表达（15℃比25℃高79倍）
Picrorhiza kurroa（胡黄连）组织培养细胞	糖酵解	HK	Hexokinase	催化	MS和FD阶段分别上调2-5倍和5-11倍
Picrorhiza kurroa（胡黄连）组织培养细胞	糖酵解	PK	Pyruvate kinase	催化	MS和FD阶段表达上调
Picrorhiza kurroa（胡黄连）组织培养细胞	三羧酸循环（TCA）	ICDH	Isocitrate dehydrogenase	催化	MS和FD阶段表达上调
Picrorhiza kurroa（胡黄连）组织培养细胞	三羧酸循环（TCA）	MDH	Malate dehydrogenase	催化	MS和FD阶段表达上调
Picrorhiza kurroa（胡黄连）组织培养细胞	磷酸戊糖途径	G6PDH	Glucose-6-phosphate dehydrogenase	催化	MS和FD阶段表达上调，为次生代谢提供前体
Picrorhiza kurroa（胡黄连）组织培养细胞	卡尔文循环（光合碳同化）	RBA	RuBisCO activase	调控	SP、MS、FD阶段上调2-4倍，参与光合调控
Picrorhiza kurroa（胡黄连）组织培养细胞	生长素信号转导	ARP	Auxin response protein	调控	SP、MS、FD阶段较CM下调
Picrorhiza kurroa（胡黄连）组织培养细胞	生长素信号转导	ARF7	Auxin response factor 7	调控	SP、MS、FD阶段较CM下调
Picrorhiza kurroa（胡黄连）组织培养细胞	细胞分裂素信号转导	HisK	Histidine kinase	调控	SP、MS、FD阶段上调6-9倍
Picrorhiza kurroa（胡黄连）组织培养细胞	细胞分裂素代谢	CytO	Cytokinin oxidase	催化	SP、MS、FD阶段上调7-12倍，降解细胞分裂素

关键发现

在P. kurroa中，P-I含量在脱分化阶段（CI和CM）从2.51 μg/mg降至不可检测水平，在再分化阶段（SP、MS、FD）逐渐回升，FD阶段由叶段和根段在15℃下分别达3.65和2.87 μg/mg。在FD阶段，7个基因（HMGR、PMK、DXPS、GS、G10H、DAHPS、PAL）在15℃相对25℃高表达32-87倍（叶源：47、57、87、52、77、59、79倍
根源：45、44、71、32、53、48、57倍）。在MS阶段，HMGR、DXPS、ISPE、G10H、DAHPS较CM阶段上调15-52倍。初级代谢基因HK、PK、ICDH、MDH、G6PDH在MS和FD阶段分别上调2-5倍和5-11倍
RBA、HisK、CytO在SP、MS、FD阶段分别上调2-4、6-9、7-12倍。在P. kurroa与P. scrophulariiflora比较中，上述7个基因在FD阶段表现出6-19倍的高表达，与P-I含量一致。

研究结论

P-I生物合成在P. kurroa中受发育阶段严格调控，HMGR、PMK、DXPS、GS、G10H、DAHPS和PAL是参与P-I合成的关键酶基因，可用于遗传改良和代谢工程以提高P-I产量。P. kurroa比P. scrophulariiflora更适合作代谢工程靶标。