Activating glutamate decarboxylase activity by removing the autoinhibitory domain leads to hyper γ-aminobutyric acid (GABA) accumulation in tomato fruit
- 作者
- Mariko Takayama, Chiaki Matsukura, Tohru Arizumi, Hiroshi Ezura
- 单位
- Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba
- 杂志
- Plant Cell Reports（2016）
- DOI
- 10.1007/s00299-016-2061-4
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何进一步提高番茄果实中γ-氨基丁酸（GABA）的积累量，以满足功能性食品开发需求；具体探索去除谷氨酸脱羧酶SIGAD3的C端自抑制结构域对GABA积累的影响。
研究策略
利用果实特异E8启动子和拟南芥热激蛋白HSP终止子构建表达元件，在番茄（Micro-Tom）中分别过表达全长SIGAD3和截去C端自抑制结构域的SIGAD3ΔC，比较不同转基因系果实中GABA含量、GAD酶活性及成熟相关性状。
研究路线图
核心内容
该研究通过去除番茄谷氨酸脱羧酶SIGAD3的C端自抑制结构域，结合果实特异E8启动子和拟南芥热激蛋白HSP终止子构建表达元件，在Micro-Tom番茄中分别过表达全长SIGAD3和截短型SIGAD3ΔC。结果显示，SIGAD3ΔC过表达系果实GABA含量达23–26 μmol/gFW，为对照的11–12倍，T1代最高达29 μmol/gFW（约295 mg/100gFW），是野生型的11–18倍。GAD酶活性测定表明，SIGAD3ΔC在无Ca²⁺/CaM条件下平均活性为对照的80.5倍，说明去除自抑制域可有效解除酶活依赖。同时，GABA过度积累导致谷氨酸和天冬氨酸含量大幅下降，GABA占总游离氨基酸的72.1–80.7%。但果实呈现橙色成熟表型，番茄红素含量降至对照的28–63%，乙烯产生峰值从Br+3延迟至Br+10，ACS2等乙烯合成基因及PSY1等类胡萝卜素基因表达延迟。该策略实现了GABA超量积累，3.4–6.8 g鲜果即可提供10–20 mg有效降压剂量，为培育高GABA功能性番茄提供了可行路径，同时揭示了GABA代谢与乙烯信号间的潜在关联。
创新点
首次在番茄中通过去除SIGAD3 C端自抑制结构域实现GABA超量积累；采用E8启动子与HSP终止子组合显著增强目标基因表达；发现GAD过度激活会延迟乙烯产生并影响果实成熟色泽，揭示GABA代谢与乙烯信号间的潜在联系。
研究对象（18）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 番茄 (Solanum lycopersicum) cv. Micro-Tom | GABA生物合成（谷氨酸脱羧途径） | SIGAD3 | 谷氨酸脱羧酶3 (GAD3) | 催化 | 全长编码序列，在E8启动子和HSP终止子控制下过表达 |
| 番茄 (Solanum lycopersicum) cv. Micro-Tom | GABA生物合成（谷氨酸脱羧途径） | SIGAD3ΔC | 截短型谷氨酸脱羧酶3 (缺少C端87nt/自抑制结构域) | 催化 | 去除C端自抑制结构域，导致GAD活性大幅升高和GABA超量积累 |
| 番茄 (Solanum lycopersicum) cv. Micro-Tom | GABA生物合成（谷氨酸脱羧途径） | SIGAD1 | 谷氨酸脱羧酶1 | 催化 | 序列比对显示其C端具有保守CaM结合基序 |
| 番茄 (Solanum lycopersicum) cv. Micro-Tom | GABA生物合成（谷氨酸脱羧途径） | SIGAD2 | 谷氨酸脱羧酶2 | 催化 | 序列比对显示其C端具有保守CaM结合基序 |
| 番茄 (Solanum lycopersicum) cv. Micro-Tom | 乙烯生物合成 | ACS2 | 1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶2 | 催化 | SIGAD3ΔC果实中表达上调延迟，与乙烯产生峰值延迟相关 |
| 番茄 (Solanum lycopersicum) cv. Micro-Tom | 乙烯生物合成 | ACS4 | 1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶4 | 催化 | SIGAD3ΔC果实中表达上调延迟 |
| 番茄 (Solanum lycopersicum) cv. Micro-Tom | 乙烯生物合成 | ACO1 | 1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶1 | 催化 | 在SIGAD3ΔC果实中表达变化不显著 |
| 番茄 (Solanum lycopersicum) cv. Micro-Tom | 类胡萝卜素生物合成 | PSY1 | 八氢番茄红素合酶1 | 催化 | SIGAD3ΔC果实中表达显著下调 |
| 番茄 (Solanum lycopersicum) cv. Micro-Tom | 类胡萝卜素生物合成 | PDS | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | SIGAD3ΔC果实中表达下调 |
| 番茄 (Solanum lycopersicum) cv. Micro-Tom | 类胡萝卜素生物合成 | ZDS | ζ-胡萝卜素脱氢酶 | 催化 | SIGAD3ΔC果实中表达下调 |
| 番茄 (Solanum lycopersicum) cv. Micro-Tom | 类胡萝卜素生物合成 | CRTISO | 类胡萝卜素异构酶 | 催化 | SIGAD3ΔC果实中表达下调 |
| 番茄 (Solanum lycopersicum) cv. Micro-Tom | 类胡萝卜素生物合成 | LCY-B | 番茄红素β-环化酶 | 催化 | SIGAD3ΔC果实中表达下调 |
| 番茄 (Solanum lycopersicum) cv. Micro-Tom | 类胡萝卜素生物合成 | CYC-B | 番茄红素β-环化酶（染色体型） | 催化 | SIGAD3ΔC果实中表达下调 |
| 番茄 (Solanum lycopersicum) cv. Micro-Tom | 果实成熟调控网络 | RIN | RIN转录因子（MADS-box） | 调控 | 在SIGAD3ΔC果实Br+3阶段表达受抑制 |
| 番茄 (Solanum lycopersicum) cv. Micro-Tom | 果实成熟调控网络 | TAGL1 | TOMATO AGAMOUS-LIKE 1转录因子 | 调控 | 在SIGAD3ΔC果实中表达显著下调 |
| 番茄 (Solanum lycopersicum) cv. Micro-Tom | 果实成熟调控网络 | FUL1 | FRUITFULL同源蛋白1（TDR4） | 调控 | 在SIGAD3ΔC果实中表达显著下调 |
| 番茄 (Solanum lycopersicum) cv. Micro-Tom | 果实成熟调控网络 | FUL2 | FRUITFULL同源蛋白2（MBP7） | 调控 | 在SIGAD3ΔC果实中表达显著下调 |
| 番茄 (Solanum lycopersicum) cv. Micro-Tom | 果实成熟调控网络 | SIERF6 | 乙烯响应因子6 | 调控 | 在SIGAD3ΔC果实Br+3至Br+10阶段表达上调 |
关键发现
- SIGAD3ΔC过表达系（T0）果实GABA含量达23–26 μmol/gFW，比对照高11–12倍；T1代果实GABA含量达19–29 μmol/gFW（约295 mg/100gFW），为对照（1.6 μmol/gFW）的11–18倍。GAD酶活性测定显示，SIGAD3ΔC在pH
- 0无Ca2+/CaM条件下平均活性为对照的80.5倍，为全长SIGAD3过表达系的48.9倍；在pH
- 8加Ca2+/CaM条件下为对照的7.3倍。SIGAD3ΔC果实中谷氨酸和天冬氨酸含量分别仅为对照的5–9%和5–12%，GABA占总游离氨基酸的72.1–80.7%。果实呈现橙色成熟表型，番茄红素含量为对照的28–63%（T1），β-胡萝卜素基本不变。乙烯产生峰值从Br+3延迟至Br+10，峰值水平与对照Br+3相当；ACS2、ACS4等乙烯合成基因表达延迟；PSY1等类胡萝卜素合成基因和RIN、TAGL1、FUL1等转录因子表达显著下调。
研究结论
去除SIGAD3 C端自抑制结构域并结合E8启动子和HSP终止子可在番茄果实中实现GABA超量积累（最高29 μmol/gFW，约295 mg/100gFW），显著高于此前报道的转基因番茄和野生种S. pennellii；3.4–6.8 g鲜果（约1–3个果实）即可提供有效降压剂量（10–20 mg GABA），为培育高GABA功能性番茄提供了有效策略。同时，过度激活GAD会影响乙烯敏感性和类胡萝卜素积累，值得进一步研究。