Identification of geranylgeranyl diphosphate synthase genes from Tripterygium wilfordii
- 作者
- Meng Zhang, Ping Su, Yong-Jin Zhou, Xiu-Juan Wang, Yu-Jun Zhao, Yu-Jia Liu, Yu-Ru Tong, Tian-Yuan Hu, Lu-Qi Huang, Wei Gao
- 单位
- School of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University; National Resource Center for Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences; Department of Chemical and Biological Engineering, Chalmers University of Technology
- 杂志
- Plant Cell Reports（2015）
- DOI
- 10.1007/s00299-015-1860-3
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
雷公藤中雷公藤甲素（triptolide）等二萜类化合物的生物合成途径尚不清楚，尤其是催化二萜共同前体牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP）合成的GGPPS基因未被鉴定。
研究策略
从雷公藤转录组中克隆GGPPS基因，通过大肠杆菌中构建次丹参酮二烯（miltiradiene）生物合成途径进行功能互补验证，并用茉莉酸甲酯诱导悬浮细胞分析基因表达与雷公藤甲素积累的相关性。
核心内容
本研究从雷公藤转录组中克隆并鉴定了6个牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶（GGPPS）基因，其中5个为全长cDNA新序列。通过在大肠杆菌BL21(DE3)中构建GGPP至次丹参酮二烯的异源合成途径进行功能互补实验，证明TwGGPPS1、TwGGPPS4和TwGGPPS5具有催化活性。对雷公藤悬浮细胞进行茉莉酸甲酯（MeJA）诱导处理，发现TwGGPPS1在诱导4小时时表达量达到对照的12.8倍，TwGGPPS4在4小时和12小时分别为2.3倍和2.5倍；同时雷公藤甲素积累在240小时达到对照的2.9倍。相关性分析显示TwGGPPS1和TwGGPPS4的表达变化与雷公藤甲素积累呈正相关，表明这两个基因很可能参与雷公藤甲素的生物合成。该研究首次从雷公藤中系统鉴定GGPPS基因家族，为阐明雷公藤甲素等二萜类活性成分的完整生物合成途径及后续代谢工程改造奠定了基础。
创新点
首次从雷公藤中克隆并鉴定了6个GGPPS基因，其中3个具有功能；通过相关性分析揭示了TwGGPPS1和TwGGPPS4参与雷公藤甲素生物合成。
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 二萜生物合成途径（GGPP→次丹参酮二烯） | TwGGPPS1 | GGPPS1 | 催化 | 功能验证可催化GGPP合成，参与次丹参酮二烯合成 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 二萜生物合成途径（GGPP→次丹参酮二烯） | TwGGPPS4 | GGPPS4 | 催化 | 功能验证可催化GGPP合成，参与次丹参酮二烯合成 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 二萜生物合成途径（GGPP→次丹参酮二烯） | TwGGPPS5 | GGPPS5 | 催化 | 功能验证可催化GGPP合成，参与次丹参酮二烯合成 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 二萜生物合成途径（GGPP→次丹参酮二烯） | SmCPS/KSL | SmCPS/KSL融合蛋白 | 催化 | 来自丹参的柯巴基焦磷酸合酶/贝壳杉烯合酶样融合蛋白，催化GGPP生成次丹参酮二烯 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | MEP途径 | — | — | 能量供给 | 大肠杆菌内源MEP途径为GGPP合成提供IPP和DMAPP |
| Tripterygium wilfordii 悬浮细胞 | 萜类生物合成途径 | TwGGPPS1 | GGPPS1 | 催化 | 定位于叶绿体，与雷公藤甲素积累正相关 |
| Tripterygium wilfordii 悬浮细胞 | 萜类生物合成途径 | TwGGPPS4 | GGPPS4 | 催化 | 定位于细胞质，与雷公藤甲素积累正相关 |
| Tripterygium wilfordii 悬浮细胞 | 萜类生物合成途径 | TwGGPPS5 | GGPPS5 | 催化 | 定位于质膜，具有GGPP合酶活性，但与雷公藤甲素积累相关性不明显 |
| Tripterygium wilfordii 悬浮细胞 | 萜类生物合成途径 | TwGGPPS2 | GGPPS2 | 催化 | 定位于质膜，具有FARM和SARM结构域，但无功能，可能为假基因 |
| Tripterygium wilfordii 悬浮细胞 | 萜类生物合成途径 | TwGGPPS3 | GGPPS3 | 催化 | 定位于叶绿体，仅含FARM，无GGPP合酶活性，可能属于SSU类 |
| Tripterygium wilfordii 悬浮细胞 | 萜类生物合成途径 | TwGGPPS6 | GGPPS6 | 催化 | 定位于叶绿体，无保守结构域，无GGPP合酶活性 |
关键发现
- 克隆了5个新的TwGGPPS全长cDNA（TwGGPPS1/3/4/5/6）并连同此前克隆的TwGGPPS2共6个基因
- TwGGPPS1、TwGGPPS4和TwGGPPS5在大肠杆菌中可参与次丹参酮二烯合成
- TwGGPPS1在MeJA诱导4h时表达量为对照的12.8倍，TwGGPPS4在4h和12h分别为2.3倍和2.5倍
- 雷公藤甲素积累在120h和240h显著增加，240h达对照的2.9倍
- TwGGPPS1和TwGGPPS4与雷公藤甲素积累正相关。
研究结论
TwGGPPS1和TwGGPPS4很可能参与雷公藤甲素的生物合成，为后续解析雷公藤甲素及其他二萜类化合物生物合成途径奠定了基础。