Isolation and functional characterisation of a novel type of carotenoid biosynthetic gene from Xanthophyllomyces dendrorhous
- 作者
- J.C. Verdoes, P. Krubasik, G. Sandmann, A.J.J. van Ooyen
- 杂志
- Molecular and General Genetics（1999）
- DOI
- 10.1007/s004380051105
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
从Xanthophyllomyces dendrorhous中分离并功能鉴定一种新型类胡萝卜素生物合成基因，该基因编码八氢番茄红素合成酶与番茄红素环化酶双功能酶。
研究策略
利用功能互补策略，在产番茄红素或积累GGPP的基因工程大肠杆菌菌株中表达X. dendrorhous的cDNA文库，筛选黄色转化子；通过序列分析和3'及5'端截短突变体定位蛋白功能域。
核心内容
本研究从红法夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous）中分离并功能鉴定了一个新型类胡萝卜素生物合成基因crtYB。该基因cDNA全长2502 bp，开放阅读框编码673个氨基酸，预测蛋白分子量为74.7 kDa。通过在大肠杆菌工程菌株中异源表达cDNA文库并进行功能互补筛选，首次发现该真菌中单一基因编码双功能酶，兼具八氢番茄红素合成酶和番茄红素环化酶活性。将全长crtYB在产GGPP的大肠杆菌中表达后，GGPP被完全转化为八氢番茄红素，产量达82.4 μg/g干重；而在产番茄红素的菌株中表达，可将番茄红素部分转化为γ-胡萝卜素（20.5 μg/g）和β-胡萝卜素（15.2 μg/g）。通过3'端和5'端截短突变体定位发现，蛋白N端负责番茄红素环化，C端负责八氢番茄红素合成——3'端截短至1878 bp时八氢番茄红素合成活性降至12.2 μg/g，进一步截短则完全丧失活性。在红法夫酵母白色突变体中回补crtYB可恢复橙色表型和虾青素合成，证实该基因在天然宿主中的功能，为虾青素的代谢工程改造提供了重要靶点。
创新点
首次发现真菌中由单一基因crtYB编码双功能类胡萝卜素合成酶（八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶）；通过异源互补实验和截短分析精确定位了两种催化活性在蛋白上的区域。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtYB | CrtYB | 催化 | 异源表达，具有八氢番茄红素合成酶和番茄红素环化酶双功能 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 类胡萝卜素生物合成 | crtYB | CrtYB | 催化 | 基因天然来源宿主，可在白色突变体PR-1-102中恢复虾青素合成 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtE | CrtE (GGPP合酶) | 催化 | 提供类胡萝卜素合成底物GGPP |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtI | CrtI (八氢番茄红素脱氢酶) | 催化 | 用于产生番茄红素或神经孢烯作为环化酶底物 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtB (来自Erwinia uredovora) | CrtB (八氢番茄红素合成酶) | 催化 | 在pACCAR25ΔcrtB质粒中被缺失，用于功能互补检测八氢番茄红素合成活性 |
关键发现
- crtYB cDNA全长2502 bp（含20 bp polyA尾），开放阅读框编码673个氨基酸，预测分子量74.7 kDa
- 在E. coli JM101[pACCRT-E]中表达crtYB使GGPP完全转化为八氢番茄红素，产量82.4 μg/g干重
- 全长crtYB在互补实验中产生76.6 μg/g玉米黄质二葡萄糖苷（八氢番茄红素合成活性），3'端截短至1878 bp时活性降至12.2 μg/g，截短至1480或1280 bp完全丧失合成活性
- 番茄红素环化酶活性方面，全长crtYB将番茄红素部分转化为γ-胡萝卜素（20.5 μg/g）和β-胡萝卜素（15.2 μg/g），截短至1878 bp时产生γ-胡萝卜素71.2 μg/g和β-胡萝卜素16.6 μg/g
- 在神经孢烯积累菌株中，crtYB可将神经孢烯转化为β-玉米胡萝卜素和7,8-二氢-β-胡萝卜素
- 在X. dendrorhous白色突变体PR-1-102中表达crtYB恢复了橙色表型和虾青素合成。
研究结论
在X. dendrorhous中，八氢番茄红素合成酶和番茄红素环化酶活性由同一个基因crtYB编码的双功能蛋白承担，其N端负责番茄红素环化，C端负责八氢番茄红素合成；该基因可用于虾青素生产的代谢工程改造。