Effects of starvation for heme on the synthesis of porphyrins in Escherichia coli
- 作者
- T. Nakayashiki, H. Inokuchi
- 杂志
- Molecular and General Genetics（1997）
- DOI
- 10.1007/s004380050509
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
大肠杆菌中血红素饥饿如何调控卟啉合成，以及该调控是否仅依赖于hemA启动子转录诱导
研究策略
利用血红素通透的hemH缺失突变株VS212，通过控制培养基中外源血红素浓度来模拟血红素饥饿，测定卟啉积累量、ALA积累量、hemA-lacZ融合基因表达及ppGpp水平，并用2-丁醇诱导严谨反应验证其作用
核心内容
该研究以血红素通透的大肠杆菌hemH缺失突变株VS212为对象，通过精确调控培养基中外源血红素浓度模拟血红素饥饿，系统考察了卟啉合成的调控机制。去除血红素后，VS212菌株的卟啉积累量从0.0043升至0.1077（OD408/OD600），提升超过20倍；VR306菌株中ALA积累量增加约7.8倍。然而，hemA-lacZ融合基因转录仅被诱导约4倍，远低于卟啉积累的增加幅度。进一步用lac启动子替换hemA启动子后，血红素饥饿仍使卟啉积累增加约4.6倍，证实存在独立于hemA启动子转录的激活途径。研究发现血红素饥饿使ppGpp水平从1491升至3260 cpm/OD600，添加2-丁醇诱导严谨反应可使卟啉积累增加最多8倍，表明严谨反应在其中发挥关键作用。该工作揭示血红素饥饿通过双重途径激活卟啉合成：既诱导hemA启动子转录，又通过ppGpp介导的严谨反应促进卟啉合成，后者可能与谷氨酰-tRNA在蛋白质合成与卟啉合成之间的分配协调有关，为理解初级代谢物反馈调控提供了新视角。
创新点
发现了独立于hemA启动子的卟啉合成激活机制，即血红素饥饿引发严谨反应（ppGpp累积）从而促进卟啉合成；假设通过glutamyl-tRNA在蛋白质合成与卟啉合成之间的分配实现协调调控
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli K-12 | 卟啉/血红素生物合成（C5途径） | hemA | 谷氨酰-tRNA还原酶 (HemA) | 催化 | 催化谷氨酰-tRNA还原为谷氨酸-1-半醛，是ALA合成的限速酶 |
| Escherichia coli K-12 | 卟啉/血红素生物合成 | hemH | 亚铁螯合酶 (Ferrochelatase) | 催化 | 催化亚铁离子插入原卟啉IX形成血红素，该基因缺失导致卟啉积累 |
| Escherichia coli K-12 | 卟啉/血红素生物合成 | hemB | ALA脱水酶 (Porphobilinogen synthase) | 催化 | 催化两分子ALA缩合为胆色素原，该基因突变导致ALA积累 |
| Escherichia coli K-12 | 严紧反应（ppGpp信号） | relA/spoT | ppGpp合成酶/水解酶 | 调控 | 血红素饥饿通过relA非依赖途径诱导ppGpp积累，介导严紧反应 |
| Escherichia coli K-12 | 蛋白质合成 | tRNA-Glu | 谷氨酰-tRNA (Glu-tRNA) | 转运 | 谷氨酰-tRNA同时作为蛋白质合成底物和卟啉合成前体，参与两者的竞争分配 |
关键发现
- 去除培养基中血红素使VS212菌株卟啉积累量从0.0043增加到0.1077（OD408/OD600），超过20倍
- VR306菌株中ALA积累量从0.119增加到0.932（OD555/OD600），约7.8倍
- hemA-lacZ融合表达仅诱导约4倍（472→136单位），而卟啉积累增加约11倍
- 用lac启动子替代hemA启动子后，血红素饥饿仍使卟啉积累从0.0049增加到0.0224（约4.6倍），表明存在非hemA启动子依赖性激活
- 添加2-丁醇可使卟啉积累增加最多8倍
- 血红素饥饿使ppGpp水平从1491 cpm/OD600升高到3260 cpm/OD600
研究结论
血红素饥饿通过双重途径激活卟啉合成：一是诱导hemA启动子转录，二是通过不依赖hemA启动子的严谨反应（ppGpp途径）促进卟啉合成，后者可能通过调节glutamyl-tRNA在蛋白质合成与卟啉合成之间的分配实现，从而协调卟啉合成与蛋白质合成