The stability of mRNA from the gsiB gene of Bacillus subtilis is dependent on the presence of a strong ribosome binding site
- 作者
- B. Jürgen, T. Schweder, M. Hecker
- 杂志
- Molecular and General Genetics（1998）
- DOI
- 10.1007/s004380050765
- 所属领域
- 分子微生物学
- 关键词
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解决的核心问题
阐明Bacillus subtilis中σB依赖的一般应激蛋白GsiB高表达机制，特别是gsiB mRNA异常稳定的分子基础。
研究策略
构建不同长度的gsiB-lacZ转录/翻译融合体，结合定点突变破坏gsiB核糖体结合位点，通过Northern blotting和β-半乳糖苷酶活性测定比较mRNA半衰期，并对gsiB、gspA、ctc三个基因的翻译信号强度与mRNA稳定性进行相关分析。
核心内容
该研究以枯草芽孢杆菌σB依赖的一般应激蛋白GsiB为对象，探究其高表达机制，重点阐明gsiB mRNA异常稳定的分子基础。作者构建不同长度的gsiB-lacZ转录/翻译融合体，并通过定点突变破坏gsiB的核糖体结合位点（RBS），结合Northern blotting和β-半乳糖苷酶活性测定比较mRNA半衰期。结果显示，gsiB mRNA在指数期和葡萄糖饥饿稳定期的半衰期均约20分钟；将RBS中3个碱基突变后，融合mRNA半衰期降至约5分钟，β-半乳糖苷酶活性降低4-5倍。进一步比较发现，gspA和ctc的mRNA半衰期分别仅5-7分钟和小于5分钟，而GsiB合成速率约为总蛋白的1.5%，远高于GspA和Ctc的0.2-0.3%。gsiB的RBS与16S rRNA反RBS有8个碱基互补，强于gspA和ctc；嘌呤霉素或氯霉素处理不影响gsiB mRNA半衰期，排除了翻译延伸的依赖。研究表明，gsiB mRNA稳定性由其强RBS决定的翻译起始强度主导，而非3'端序列；强RBS通过促进核糖体结合保护mRNA免受5'端核酸酶降解。这揭示了σB依赖基因mRNA稳定性与翻译信号强度正相关的规律，解释了应激条件下GsiB选择性高积累的机制。
创新点
首次证明强核糖体结合位点（RBS）是决定gsiB mRNA高稳定性的关键因素，并提出翻译起始强度与mRNA稳定性呈正相关的规律。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Bacillus subtilis IS58 | σB依赖的一般应激反应 | gsiB | GsiB | 调控 | 编码小疏水蛋白，mRNA半衰期约20分钟，强RBS使其稳定 |
| Bacillus subtilis IS58 | σB依赖的一般应激反应 | gspA | GspA | 调控 | mRNA半衰期5-7分钟，翻译信号弱于gsiB |
| Bacillus subtilis IS58 | σB依赖的一般应激反应 | ctc | Ctc | 调控 | mRNA半衰期小于5分钟，翻译信号最弱 |
| Escherichia coli DH5α | 克隆宿主 | lacZ | β-半乳糖苷酶 | 催化 | 作为报告基因用于构建gsiB-lacZ融合体 |
关键发现
- gsiB mRNA在指数期和葡萄糖饥饿稳定期的半衰期均约20分钟
- 定点突变gsiB RBS中3个碱基后，gsiB-lacZ融合mRNA半衰期降至约5分钟，β-半乳糖苷酶活性降低4-5倍
- 在葡萄糖饥饿条件下，gspA mRNA半衰期5-7分钟，ctc mRNA半衰期小于5分钟
- 通过2D凝胶电泳定量，GsiB合成速率约为总蛋白的1.5%，而GspA和Ctc仅0.2-0.3%
- gsiB的RBS与16S rRNA反RBS有8个碱基互补，强于gspA和ctc
- 加入嘌呤霉素或氯霉素不影响gsiB mRNA半衰期。
研究结论
gsiB mRNA的稳定性由其翻译起始区（特别是强RBS）决定，而非3'端序列；强RBS通过促进核糖体结合/翻译起始保护mRNA免受5'端核酸酶降解；σB依赖基因gsiB、gspA、ctc的mRNA稳定性与其翻译信号强度呈正相关，这一机制决定了GsiB在应激条件下更高的积累水平。