Combining De Ley-Doudoroff and methylerythritol phosphate pathways for enhanced isoprene biosynthesis from D-galactose
- 作者
- Kristine Rose M. Ramos, Kris Nino G. Valdehuesa, Huawei Liu, Grace M. Nisola, Won-Keun Lee, Wook-Jin Chung
- 单位
- Department of Energy and Biotechnology (DEB), Energy and Environment Fusion Technology Center (E2FTC), Myongji University; Division of Bioscience and Bioinformatics, Myongji University
- 杂志
- Bioprocess and Biosystems Engineering（2014）
- DOI
- 10.1007/s00449-014-1228-z
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
如何通过平衡MEP途径前体甘油醛-3-磷酸（G3P）和丙酮酸的供应，提高大肠杆菌利用D-半乳糖合成异戊二烯的效率
研究策略
敲除galK基因阻断Leloir途径，引入假单胞菌的gld基因完成De Ley-Doudoroff（DD）途径，使D-半乳糖定向流向DD途径并等摩尔生成G3P和丙酮酸；同时过表达MEP途径瓶颈基因dxs、idi和异源异戊二烯合酶ispS，增强异戊二烯合成
核心内容
该研究通过重构大肠杆菌的D-半乳糖代谢路径，旨在平衡MEP途径前体甘油醛-3-磷酸（G3P）和丙酮酸的供应，以提高异戊二烯的合成效率。研究者敲除galK基因阻断Leloir途径，并引入假单胞菌的gld基因，使D-半乳糖经De Ley-Doudoroff（DD）途径代谢，等摩尔生成G3P和丙酮酸；同时过表达MEP途径瓶颈基因dxs、idi及异源异戊二烯合酶ispS。结果显示，DD-MEP耦合菌株EBW14的G3P/丙酮酸比接近1:1，而对照菌株为0.42；在M9半乳糖培养基中，EBW14异戊二烯产量达7.14 mg/L，比产量124.29 mg/g DCW，产率1.21% mol/mol，均显著高于Leloir-MEP菌株EBW13。在富集培养基中，EBW14产量进一步升至264.21 mg/L，为EBW13的3.8倍。值得注意的是，尽管EBW14总前体浓度比EBW13低52.23%，且半乳糖消耗更少，其产量反而更高，表明前体供应的化学计量平衡比单纯增加浓度更为关键。该策略为高效生产异戊二烯及其他异戊二烯类化合物提供了新的代谢工程平台。
创新点
1. 构建了完整的DD途径与MEP途径耦合的大肠杆菌菌株；2. 利用galK缺失使D-半乳糖专一流向DD途径；3. 引入异源gld实现D-半乳糖脱氢；4. 证明等摩尔G3P/丙酮酸供应可显著提高异戊二烯产量；5. 即使总前体浓度降低，平衡的供应比单纯增加浓度更有效
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BW25113 ΔgalK (EWG2/EBW14) | De Ley-Doudoroff pathway | gld | D-galactose dehydrogenase (GalDH) | 催化 | 来自Pseudomonas syringae，催化D-半乳糖氧化为D-半乳糖酸，完成DD途径第一步 |
| Escherichia coli BW25113 (及ΔgalK突变体) | Leloir pathway | galK | galactokinase | 催化 | 催化D-半乳糖磷酸化为半乳糖-1-磷酸；本研究敲除该基因以阻断Leloir途径，在EBW13.1中过表达但效果不佳 |
| Escherichia coli BW25113 (EBW13/EBW14) | Methylerythritol phosphate (MEP) pathway | dxs | 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase (Dxs) | 催化 | 催化G3P与丙酮酸缩合生成DXP，是MEP途径的关键酶，过表达用于解除瓶颈 |
| Escherichia coli BW25113 (EBW13/EBW14) | Methylerythritol phosphate (MEP) pathway | idi | isopentenyl diphosphate isomerase (Idi) | 催化 | 催化IPP与DMAPP相互转化，过表达以增强异戊二烯前体供应 |
| Escherichia coli BW25113 (EBW13/EBW14) | Methylerythritol phosphate (MEP) pathway | ispS | isoprene synthase | 催化 | 来自Populus alba，异源表达，催化DMAPP生成异戊二烯 |
关键发现
- EWG2菌株在12h积累D-半乳糖酸0.57±0.03 g/L，48h为0.49±0.01 g/L
- 野生型G3P/丙酮酸比为0.42，EWG2为0.90
- 在M9+半乳糖培养基中，EBW14（DD-MEP）异戊二烯产量7.14±0.71 mg/L，比产量124.29±10.16 mg/g DCW，产率1.21% mol/mol，而EBW13（Leloir-MEP）为6.16±0.09 mg/L，17.42±2.26 mg/g DCW，0.56% mol/mol
- 添加酵母提取物和半乳糖后，EBW14异戊二烯产量达264.21±4.60 mg/L，EBW13为69.82±6.07 mg/L
- EBW14消耗半乳糖2.67±0.01 g/L，低于EBW13的3.68±0.03 g/L，且分泌54.4% mol/mol的半乳糖酸
- 在双碳源下，EBW14的G3P/丙酮酸接近1:1，而EBW13中丙酮酸始终高于G3P
- EBW14的总前体浓度比EBW13低52.23%，但异戊二烯产量更高。
研究结论
将D-半乳糖代谢从EMP途径转向DD途径，能够为MEP途径提供等摩尔的G3P和丙酮酸，从而显著提高异戊二烯产量。该策略为开发高效的异戊二烯及其他异戊二烯类化合物生产菌株提供了新平台。