Enhancement of xylitol production in glycerol kinase disrupted Candida tropicalis by co-expression of three genes involved in glycerol metabolic pathway
- 作者
- Irshad Ahmad, Woo Yong Shim, Jung-Hoe Kim
- 杂志
- Bioprocess and Biosystems Engineering（2012）
- DOI
- 10.1007/s00449-012-0872-4
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何在Candida tropicalis中通过调控甘油代谢路径来增强NADPH再生，从而提高木糖醇产量。
研究策略
敲除甘油激酶基因(gk)，阻断甘油磷酸化途径，使菌株无法利用甘油；随后共表达来自Scheffersomyces stipitis的gcy1、gcy2和gcy3基因（编码NADP+依赖的甘油脱氢酶），在GAPDH启动子控制下引入氧化途径，利用甘油再生NADPH，进而增强木糖醇的合成。
核心内容
本研究在热带假丝酵母（Candida tropicalis）中通过代谢工程策略增强NADPH再生以提高木糖醇产量。首先敲除甘油激酶基因gk，阻断甘油磷酸化途径，使菌株无法利用甘油作为唯一碳源；随后在GAPDH启动子控制下共表达来自树干毕赤酵母的gcy1、gcy2和gcy3基因，编码NADP⁺依赖的甘油脱氢酶，重新引入甘油氧化途径，利用甘油再生NADPH，为木糖还原酶提供还原力。重组GDH1、GDH2和GDH3在大肠杆菌中的比活性分别为0.02±0.0012、0.01±0.0010和0.03±0.0014 U/mg蛋白。在含50 g/L木糖和20 g/L甘油的发酵培养基中，工程菌株GK于16 h和24 h的木糖醇生产速率分别为0.85 g L⁻¹ h⁻¹和1.28 g L⁻¹ h⁻¹，较亲本菌株BSXDH-3分别提高30%和18%。该策略首次在C. tropicalis中实现gk基因破坏并同时共表达三个甘油代谢相关基因，为利用甘油作为辅助底物增强微生物代谢产物生产提供了有效途径。
创新点
首次在Candida tropicalis中实现了gk基因破坏，并同时共表达gcy1、gcy2和gcy3基因用于NADPH再生和木糖醇产量提升。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Candida tropicalis BSXDH-3 | 甘油代谢途径（磷酸化途径） | gk | 甘油激酶（GK） | 催化 | 基因被破坏，导致菌株无法在甘油上生长 |
| Candida tropicalis GK | 甘油代谢途径（氧化途径） | gcy1, gcy2, gcy3 | NADP+依赖的甘油脱氢酶1、2、3（GDH1、GDH2、GDH3） | 催化 | 共表达，用于恢复甘油利用并再生NADPH |
| Candida tropicalis BSXDH-3 | 木糖醇合成途径 | XYL2 | 木糖醇脱氢酶（XDH） | 催化 | 先前已敲除，使木糖醇无法被进一步代谢而积累 |
| Candida tropicalis | 木糖醇合成途径 | — | 木糖还原酶（XR） | 催化 | 内源酶，催化木糖还原为木糖醇，未直接操作 |
关键发现
- ['gk基因敲除后，C. tropicalis菌株无法在以甘油为唯一碳源的培养基上生长
- 共表达gcy1、gcy2和gcy3基因后恢复甘油利用能力。', '重组GDH1、GDH2和GDH3在E. coli BL21中的比活性分别为0.02±0.0012、0.01±0.0010和0.03±0.0014 U/mg蛋白。', '在含50 g/L木糖和20 g/L甘油的发酵培养基中，工程菌株GK在16 h和24 h的木糖醇生产速率分别为0.85 g L^-1 h^-1和1.28 g L^-1 h^-1，较亲本菌株BSXDH-3分别提高30%和18%。']
研究结论
通过破坏gk基因并引入S. stipitis的氧化甘油代谢途径（gcy1、gcy2和gcy3），成功构建了能够在甘油上生长且NADPH再生能力增强的C. tropicalis工程菌株GK，显著提高了木糖醇的生产速率。该策略为利用甘油作为辅助底物增强微生物代谢产物生产提供了有效途径。