高级醇 · 代谢工程文献库

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Effect of heterologous xylose transporter expression in Candida tropicalis on xylitol production rate

作者
Woo Young Jeon, Woo Yong Shim, Sung Hyeon Lee, Joon Ho Choi, Jung Hoe Kim
单位
Biotechnology Process Engineering Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB); Department of Biological Sciences, Korea Advanced Institute of Science and Technology; Department of Food Science and Biotechnology, College of Life Science and Natural Resources, Wonkwang University
杂志
Bioprocess and Biosystems Engineering（2013）
DOI
10.1007/s00449-013-0907-5
所属领域
代谢工程
关键词
Candida tropicalisCodon optimizationXylitolXylose transporter
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解决的核心问题

葡萄糖对木糖摄取的竞争性抑制限制了热带假丝酵母在葡萄糖/木糖混合糖发酵中的木糖利用速率，进而影响木糖醇的生产率。

研究策略

从拟南芥中筛选高亲和力木糖转运蛋白基因At5g17010，依据热带假丝酵母密码子偏好性进行密码子优化（CoXT2），在GAPDH启动子控制下整合到已表达NXRG的木糖醇脱氢酶缺陷菌株LXU1基因组中构建重组菌LXT2，通过摇瓶发酵和Western blot验证其木糖摄取与木糖醇生产性能。

研究路线图

100%
葡萄糖竞争性抑制木糖摄取，降低木糖醇生产率
策略：筛选拟南芥木糖转运蛋白并密码子优化
关键改造一：从At5g17010出发，按热带假丝酵母偏好优化为CoXT2
关键改造二：GAPDH启动子驱动CoXT2整合至NXRG+/xyl2Δ（LXU1）菌株，构建LXT2
关键改造三：摇瓶发酵+Western blot验证表达与定位
结果：木糖摄取速率提高37–74%，木糖醇生产率提高25–30%
结论：异源木糖转运蛋白增强混合糖中木糖摄取与木糖醇生产速率
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核心内容

针对热带假丝酵母在葡萄糖/木糖混合糖发酵中因葡萄糖竞争抑制导致木糖利用慢、木糖醇生产率受限的问题，本研究尝试通过异源表达木糖转运蛋白加以改善。研究者从拟南芥中筛选出高亲和力木糖转运蛋白基因At5g17010，依据热带假丝酵母密码子偏好性进行优化后命名为CoXT2，在GAPDH启动子驱动下整合至木糖醇脱氢酶缺陷菌株LXU1基因组，构建重组菌LXT2。摇瓶发酵结果显示，在葡萄糖/木糖比例为1:1、1:2和0:1的培养基中，LXT2的木糖摄取速率分别达1.23、1.60和3.20 g/L/h，较对照菌LXU1提高74%、70%和37%；500 mL摇瓶发酵中，12–42 h的木糖醇体积生产率达1.14 g/L/h，较对照提高25%，对应生产速率提高30%。Western blot与膜蛋白提取证实该转运蛋白（预测分子量53.4 kDa）成功表达并定位于质膜。结果表明，异源表达木糖转运蛋白能有效缓解葡萄糖对木糖摄取的抑制，显著提升混合糖发酵中木糖醇的生产效率，为工业菌株改造提供了可行策略。

创新点

首次在热带假丝酵母中异源表达木糖转运蛋白；通过密码子优化实现功能性表达；在葡萄糖/木糖混合糖中使木糖摄取速率提高37–74%，木糖醇体积生产率提高25%。

研究对象（4）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Candida tropicalis 木糖摄取与木糖醇合成 At5g17010 (CoXT2) 木糖转运蛋白 转运 来自拟南芥的高亲和力木糖转运蛋白，经密码子优化后在C. tropicalis中表达并定位于质膜
Candida tropicalis 木糖代谢（木糖→木糖醇） NXRG 木糖还原酶 催化 密码子优化的粗糙脉孢菌木糖还原酶，由GAPDH启动子驱动表达，催化木糖转化为木糖醇
Candida tropicalis 木糖醇代谢（木糖醇→木酮糖） XYL2 木糖醇脱氢酶 催化 该基因被破坏（xyl2Δ），使菌株积累木糖醇
Candida tropicalis 基因表达调控 GAPDH promoter — 调控 组成型启动子，用于驱动NXRG和CoXT2的表达

关键发现

  1. 在葡萄糖/木糖比例为1:1、1:2和0:1的介质中，重组菌LXT2的木糖摄取速率分别为1.23、1.60和3.20 g/L/h，较对照菌LXU1分别提高74%、70%和37%
  2. 500 mL摇瓶发酵中，LXT2在12–42 h的木糖摄取速率提高29%，木糖醇体积生产率达到1.14 g/L/h，较对照提高25%
  3. 12–42 h的木糖醇生产速率为1.57 g/L/h，提高30%
  4. Western blot与膜蛋白提取确认异源转运蛋白（预测分子量53.4 kDa）成功表达并定位于质膜。

研究结论

在热带假丝酵母中表达异源木糖转运蛋白有效增强了葡萄糖/木糖混合糖中的木糖摄取，从而提高了木糖醇的生产率；尽管初始阶段异源蛋白表达略有抑制生长，但后期木糖醇生产速率显著高于对照菌。