Isobutanol production in engineered Saccharomyces cerevisiae by overexpression of 2-ketoisovalerate decarboxylase and valine biosynthetic enzymes
- 作者
- Won-Heong Lee, Seung-Oh Seo, Yi-Hyun Bae, Hong Nan, Yong-Su Jin, Jin-Ho Seo
- 单位
- Department of Food Science and Human Nutrition, University of Illinois at Urbana-Champaign; Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign; Department of Agricultural Biotechnology, Center for Agricultural Biomaterials, Seoul National University
- 杂志
- Bioprocess and Biosystems Engineering（2012）
- DOI
- 10.1007/s00449-012-0736-y
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在酿酒酵母中构建高效异丁醇生产体系，解决内源2-酮异戊酸脱羧酶活性不足及前体供应受限的问题。
研究策略
筛选并过表达对2-酮异戊酸具有高特异性的2-酮酸脱羧酶（Kivd），同时组合过表达胞质定位的缬氨酸生物合成酶（Ilv2p、Ilv3p、Ilv5p）以增强前体2-酮异戊酸的供应。
核心内容
本研究在酿酒酵母D452-2中构建异丁醇合成途径，针对内源2-酮异戊酸脱羧酶活性不足和前体供应受限两个瓶颈进行代谢工程改造。通过筛选不同来源的2-酮酸脱羧酶，鉴定出乳酸乳球菌KACC 13877来源的Kivd为最适酶，其比酶活为0.69 U/mg，较对照提高1.5倍。在此基础上，采用去除线粒体靶向序列的截短ILV2、ILV3、ILV5基因实现胞质定位表达，增强缬氨酸合成途径以补充前体2-酮异戊酸。结果表明，单独过表达Kivd使异丁醇产量达93 mg/L，较对照的22 mg/L提高4倍；额外共表达三个缬氨酸合成酶后产量进一步增至151 mg/L，较仅表达Kivd提升60%以上。添加外源2-酮异戊酸可显著增加产量，验证了前体供应对异丁醇合成的限制作用。该研究说明筛选高特异性脱羧酶并解除线粒体转运限制是酵母合成异丁醇的有效策略，但碳流向乙醇的竞争分流仍是限制产量进一步提升的关键因素。
创新点
鉴定出乳酸乳球菌KACC 13877来源的Kivd为最适脱羧酶；采用去除线粒体靶向序列的截短ILV基因实现胞质表达，避免线粒体转运限制，从而有效提高异丁醇产量。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae D452-2 | 异丁醇生物合成 | kivd | Kivd | 催化 | 来自乳酸乳球菌KACC 13877，催化2-酮异戊酸脱羧生成异丁醛 |
| Saccharomyces cerevisiae D452-2 | 缬氨酸生物合成 | ILV2 | Ilv2p | 催化 | 乙酰乳酸合酶，截短去除线粒体靶向序列，胞质表达 |
| Saccharomyces cerevisiae D452-2 | 缬氨酸生物合成 | ILV3 | Ilv3p | 催化 | 二羟酸脱水酶，截短去除线粒体靶向序列，胞质表达 |
| Saccharomyces cerevisiae D452-2 | 缬氨酸生物合成 | ILV5 | Ilv5p | 催化 | 乙酰羟酸还原异构酶，截短去除线粒体靶向序列，胞质表达 |
关键发现
- 过表达Kivd使异丁醇产量达93 mg/L，较对照（22 mg/L）提高4倍
- 额外过表达ILV2、ILV3和ILV5后产量进一步增至151 mg/L，较仅表达Kivd提高60%以上。Kivd的比酶活为0.69 U/mg，较对照（0.46 U/mg）高1.5倍。添加外源2-酮异戊酸可显著提高异丁醇产量。对照菌株D-56和仅过表达ILV2-3-5的菌株D-I253产量分别为22和17 mg/L。
研究结论
过表达特异性Kivd是酿酒酵母生产异丁醇的关键，结合缬氨酸生物合成酶的胞质过表达可显著提高产量；未来需进一步调节碳流从乙醇转向异丁醇。