High-level extracellular production of D-Psicose-3-epimerase with recombinant Escherichia coli by a two-stage glycerol feeding approach

作者: Lei Gu, Juan Zhang, Baihong Liu, Chongde Wu, Guocheng Du, Jian Chen
单位: Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University; School of Biotechnology, Jiangnan University; College of Light Industry, Textile and Food Engineering, Sichuan University; The Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University; National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University
杂志: Bioprocess and Biosystems Engineering（2013）
DOI: 10.1007/s00449-013-0952-0
所属领域: 代谢工程
关键词: Agrobacterium tumefaciensBioconversionD-Psicose-3-epimeraseEscherichia coliExtracellular expressionTwo-stage glycerol feeding
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解决的核心问题

实现D-阿洛酮糖-3-差向异构酶（DPE）在大肠杆菌中的高水平胞外分泌表达，以简化下游处理并提高D-阿洛酮糖生产效率。

研究策略

通过人工合成密码子优化的DPE基因，利用pelB信号肽实现分泌表达；优化培养基、诱导温度和诱导剂浓度；添加甘氨酸增加细胞膜通透性；在3-L发酵罐中采用两阶段甘油补料策略（诱导前指数补料，诱导后恒速补料）结合高密度培养。

研究路线图

100%

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核心内容

本研究通过重组大肠杆菌实现D-阿洛酮糖-3-差向异构酶（DPE）的高水平胞外分泌表达。研究采用密码子优化的DPE基因与pelB信号肽构建分泌表达系统，系统优化了培养基、诱导温度及IPTG浓度，并通过添加甘氨酸增强细胞膜通透性。在3-L发酵罐中，采用两阶段甘油补料策略（诱导前指数补料、诱导后恒速补料）结合高密度培养，最终在最优诱导细胞密度（30 g/L DCW）下获得83.6 g/L的最终细胞密度，总DPE活性达24.1 U/mL，其中胞外活性10.9 U/mL（1240 mg/L），较摇瓶水平提高3.11倍。使用复杂氮源补料时，胞外活性较对照提高3.4倍。以700 g/L D-果糖为底物，胞外DPE催化生产D-阿洛酮糖的产率达179 g/L（转化率25.5%）。该策略首次实现DPE的胞外分泌表达，显著简化了下游纯化步骤，为D-阿洛酮糖的工业化生物转化提供了高效可行的技术方案。

创新点

首次实现DPE的胞外分泌表达；结合甘氨酸添加与两阶段甘油补料策略，显著提高胞外DPE活性；系统优化了培养基、诱导条件和补料策略。

研究对象（2）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Escherichia coli BL21(DE3)	重组蛋白分泌表达	pelB	PelB信号肽	转运	介导DPE向胞外分泌
Escherichia coli BL21(DE3)	D-阿洛酮糖合成途径	AAL45544.1	D-Psicose-3-epimerase (DPE)	催化	催化D-果糖与D-阿洛酮糖的异构化

关键发现

摇瓶优化后总DPE活性达3.96 U/mL（1.5 mM IPTG诱导），胞外活性1.70 U/mL
添加150 mM甘氨酸后胞外活性达3.5 U/mL，蛋白浓度408 mg/L。在3-L发酵罐中采用两阶段甘油补料策略，最优诱导细胞密度为30 g/L DCW，最终DCW达83.6 g/L，总DPE活性24.1 U/mL，其中胞外10.9 U/mL（1240 mg/L）、胞内13.2 U/mL
胞外活性较摇瓶提高3.11倍。使用复杂氮源补料时，胞外活性较对照提高3.4倍（10.9 vs 3.4 U/mL）。以700 g/L D-果糖为底物，胞外DPE转化D-果糖至D-阿洛酮糖的产率达179 g/L（转化率25.5%），胞内DPE产率218 g/L（转化率31.1%）。

研究结论

通过pelB信号肽、甘氨酸添加和两阶段甘油补料策略，成功实现了DPE在大肠杆菌中的高水平胞外分泌，为D-阿洛酮糖的工业生物转化提供了可行方案。