Partial deletion of rng (RNase G)-enhanced homoothanol fermentation of xylose by the non-transgenic Escherichia coli RM10
- 作者
- Ryan Manow, Jinhua Wang, Yongze Wang, Jinfang Zhao, Erin Garza, Andrew Iverson, Chris Finan, Scott Grayburn, Shengde Zhou
- 杂志
- Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology（2012）
- DOI
- 10.1007/s10295-012-1100-6
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
非转基因大肠杆菌菌株SZ470无法完成75 g/L木糖发酵，乙醇产量低，原因是乙醇脱氢酶（AdhE）表达不足，导致乙酰辅酶A转化为乙醇的步骤成为限速步骤。
研究策略
通过部分删除rng基因的HSR2区域（编码RNase G的DNase I亚结构域）提高adhE及多个糖酵解/乙醇通路基因的mRNA水平，同时尝试删除cra基因，以改善高浓度木糖和阿拉伯糖的同型乙醇发酵。
核心内容
针对非转基因大肠杆菌SZ470在75 g/L木糖发酵中乙醇产量低的问题，该研究通过对编码RNase G的rng基因HSR2区域进行部分删除构建了菌株RM10。部分删除策略在将adhE mRNA稳定性提高409倍、AdhE酶活提升逾2倍的同时，保留了16S rRNA加工功能，并显著上调了pgi、tpiA、gapA、eno等糖酵解基因及aceEF-lpd、fnr的mRNA水平。RM10在84小时内完成75 g/L木糖发酵，乙醇滴度达35 g/L，较亲本提高84%，产率从52%升至92%；在阿拉伯糖发酵中亦实现72小时完成、产率90%。进一步研究发现删除cra基因或cra与rng双缺失均对细胞生长和发酵产生负面影响，表明Cra对长期发酵不可或缺。该工作证实部分删除RNase G的HSR2结构域是提升非转基因菌株同型乙醇发酵效率的有效靶点。
创新点
采用部分删除rng（RNase G）的HSR2区域而非完全敲除，既提高了adhE mRNA稳定性（409倍）和AdhE酶活（>2倍），又保持了16S rRNA加工功能，且属于非转基因改造，减少了公众和监管顾虑。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli (非转基因菌株RM10及其亲本SZ470) | 同型乙醇发酵通路 | rng | RNase G | 调控 | 部分删除HSR2区域（110 bp）提高adhE mRNA稳定性，使adhE mRNA水平提高409倍 |
| Escherichia coli (非转基因菌株RM10及其亲本SZ470) | 同型乙醇发酵通路 | cra | Cra（分解代谢物阻遏激活蛋白） | 调控 | 转录调控因子，负调控adhE表达；删除后对细胞生长和发酵产生负面影响 |
| Escherichia coli (非转基因菌株RM10及其亲本SZ470) | 同型乙醇发酵通路 | adhE | 乙醇脱氢酶（AdhE） | 催化 | 负责乙酰辅酶A还原为乙醇；rng HSR2缺失后mRNA提高409倍，酶活提高>2倍 |
| Escherichia coli (非转基因菌株RM10及其亲本SZ470) | 同型乙醇发酵通路 | aceEF-lpd | 丙酮酸脱氢酶复合体（PDH） | 催化 | 由pflB启动子厌氧表达，将丙酮酸转化为乙酰辅酶A；rng HSR2缺失后mRNA提高64倍 |
| Escherichia coli (非转基因菌株RM10及其亲本SZ470) | 同型乙醇发酵通路 | fnr | Fnr（延胡索酸/硝酸盐还原调控蛋白） | 调控 | 转录调控因子，增强厌氧基因表达；rng HSR2缺失后mRNA提高88倍 |
| Escherichia coli (非转基因菌株RM10及其亲本SZ470) | 糖酵解 | pgi | 磷酸葡萄糖异构酶 | 催化 | rng HSR2缺失后mRNA提高88倍 |
| Escherichia coli (非转基因菌株RM10及其亲本SZ470) | 糖酵解 | tpiA | 磷酸丙糖异构酶 | 催化 | rng HSR2缺失后mRNA提高78倍 |
| Escherichia coli (非转基因菌株RM10及其亲本SZ470) | 糖酵解 | gapA | 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 | 催化 | rng HSR2缺失后mRNA提高47倍 |
| Escherichia coli (非转基因菌株RM10及其亲本SZ470) | 糖酵解 | eno | 烯醇化酶 | 催化 | rng HSR2缺失后mRNA提高164倍 |
关键发现
- 删除rng HSR2后，adhE mRNA水平提高409倍，AdhE活性增加超过2倍；pgi、tpiA、gapA、eno等糖酵解基因mRNA分别提高88倍、78倍、47倍、164倍；aceEF-lpd提高64倍，fnr提高88倍。RM10在75 g/L木糖发酵中完成发酵（84 h），乙醇滴度35 g/L，比亲本SZ470的19 g/L提高84%，乙醇产率从52%提高到92%（基于初始糖）；最大细胞量6.89 g/L vs
- 44 g/L（提高29%）；最大体积生产力0.509 g L-1 h-1 vs
- 423 g L-1 h-1。RM10在75 g/L阿拉伯糖发酵中72 h完成，乙醇滴度34.5 g/L，产率90%，最大细胞量7.50 g/L。删除cra（RM03）和cra+rng双缺失（RM07）均对细胞生长和木糖发酵产生负面影响，表明Cra对长期发酵生长至关重要。
研究结论
rng HSR2部分缺失通过增强adhE及其他糖酵解/乙醇通路基因的表达，使非转基因大肠杆菌RM10能够高效完成75 g/L木糖和阿拉伯糖发酵，显著提高乙醇产量和产率；而cra缺失不利于长期发酵生长，明确了RNase G HSR2是提高同型乙醇发酵效率的有效靶点。