An improved method of xylose utilization by recombinant Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Tien-Yang Ma, Ting-Hsiang Lin, Teng-Chieh Hsu, Chiung-Fang Huang, Gia-Luen Guo, Wen-Song Hwang
- 杂志
- Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology（2012）
- DOI
- 10.1007/s10295-012-1153-6
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
优化重组酿酒酵母中木糖代谢酶（木糖还原酶、木糖醇脱氢酶、木酮糖激酶）的基因表达比例与水平，以提高木糖利用能力和乙醇产量，减少木糖醇积累。
研究策略
构建携带木糖还原酶基因（CXYL1）的整合质粒pAURC1，整合至aur1位点；构建携带NADP+依赖型木糖醇脱氢酶突变体（XYL2M）和木酮糖激酶（XK）基因的整合质粒p5SXYL2M和p5SXK，共同转化并整合至5S rDNA位点，建立不同基因拷贝数比例的酵母文库，在YPX（木糖）培养基上筛选生长良好且木糖发酵性能优良的菌株。
核心内容
该研究针对重组酿酒酵母木糖利用效率低、木糖醇积累多的问题，通过染色体整合策略优化木糖代谢三个关键酶（木糖还原酶XR、NADP⁺依赖型木糖醇脱氢酶突变体XYL2M、木酮糖激酶XK）的表达比例与水平。利用5S rDNA多位点随机整合构建不同基因拷贝数组合的酵母文库，在木糖平板上直接筛选获得最优菌株YY5A。结果显示，YY5A的木糖消耗速率为2.32 g/gDCW/h，是亲本菌株YY2KL的2.34倍，乙醇产量提高1.83倍；在2%木糖发酵中24小时木糖消耗率达93.7%，乙醇得率0.33 g/g消耗木糖；混合糖发酵中24小时消耗96.5%木糖，最大乙醇产量17.5 g/L。酶活测定表明，筛选菌株的XR活性提高6.7倍，NADP⁺依赖型XDH活性达10.963 U/mg，XK活性达3.111 U/mg，而亲本几乎无XK活性。该研究证实了木糖代谢酶比例与表达水平对木糖乙醇转化效率的决定性作用，所建立的文库筛选策略为酵母中多酶系统的代谢工程优化提供了通用且高效的方法。
创新点
1. 利用5S rDNA多位点随机整合策略构建木糖代谢酶基因比例不同的重组酵母文库，并通过木糖平板直接筛选最优菌株；2. 引入NADP+依赖的木糖醇脱氢酶突变体（XYL2M，D207A/I208R/F209S/N211R）以改善辅因子平衡、减少木糖醇积累；3. 通过染色体整合精确调控酶基因表达水平，实现快速有效的菌株优化。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 木糖还原酶-木糖醇脱氢酶（XR-XDH）途径 | CXYL1 | 木糖还原酶（XR） | 催化 | 来自Candida guilliermondii，NADPH依赖，催化木糖还原为木糖醇 |
| Saccharomyces cerevisiae | 木糖还原酶-木糖醇脱氢酶（XR-XDH）途径 | XYL2M | 木糖醇脱氢酶突变体（XDHm） | 催化 | 来自Pichia stipitis，含D207A/I208R/F209S/N211R四个突变，偏好NADP+，催化木糖醇氧化为木酮糖 |
| Saccharomyces cerevisiae | 木糖代谢途径 | XKS1 | 木酮糖激酶（XK） | 催化 | 来自Pichia stipitis，催化木酮糖磷酸化为5-磷酸木酮糖 |
| Saccharomyces cerevisiae | 戊糖磷酸途径 | TAL1 | 转醛醇酶 | 催化 | 存在于亲本YY2KL中，参与木糖代谢非氧化阶段，由TEF启动子驱动 |
关键发现
- 筛选到的重组菌株YY5A的木糖消耗速率为2.32 g/gDCW/h，是亲本菌株YY2KL（0.99 g/gDCW/h）的2.34倍
- 乙醇产量提高了1.83倍。在2%木糖发酵中，YY5A的24h木糖消耗率为93.7%，木糖醇产量1.5 g/L，乙醇产量6.1 g/L，乙醇得率0.33 g/g消耗木糖
- 在4%木糖下，木糖消耗速率为0.41 g/gDCW/h，乙醇得率0.38 g/g消耗木糖。混合糖（22 g/L葡萄糖+24 g/L木糖）发酵中，YY5A在24h内消耗96.5%的木糖，最大乙醇产量17.5 g/L，得率0.36 g/g总糖。酶活测定显示，YYA1的XR活性比YY2KL高6.7倍（1.551 vs 0.233 U/mg），YY5A的NADP+依赖XDH活性高达10.963 U/mg，XK活性为3.111 U/mg，而亲本仅为0.013 U/mg。
研究结论
木糖代谢酶（XR、XDH、XK）的活性比例和表达水平对木糖向乙醇的高效转化至关重要。本研究开发的新方法能够快速有效地筛选出酶比例优化的木糖利用酵母菌株，该方法有望推广到酵母中其他多酶系统的代谢工程。