Construction of lactose-consuming Saccharomyces cerevisiae for lactose fermentation into ethanol fuel
- 作者
- Jing Zou, Xuewu Guo, Tong Shen, Jian Dong, Cuiying Zhang, Dongguang Xiao
- 杂志
- Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology（2013）
- DOI
- 10.1007/s10295-012-1227-5
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
酿酒酵母缺乏乳糖通透酶和β-半乳糖苷酶，无法直接发酵乳清中的乳糖生产乙醇；已有工程菌株存在遗传不稳定或葡萄糖阻遏导致乳糖利用效率低的问题。
研究策略
将克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）的LAC4（β-半乳糖苷酶）和LAC12（乳糖通透酶）基因整合到酿酒酵母AY-5基因组中，分别以ATH1/NTH1基因座（菌株AY-51024A）或MIG1/NTH1基因座（菌株AY-51024M）为整合位点，从而破坏海藻糖酶基因或解除葡萄糖阻遏，并通过二倍体杂交获得稳定菌株。
核心内容
本研究将克鲁维酵母来源的LAC4（β-半乳糖苷酶）和LAC12（乳糖通透酶）基因整合至酿酒酵母AY-5基因组，分别以ATH1/NTH1基因座（菌株AY-51024A）或MIG1/NTH1基因座（菌株AY-51024M）作为整合位点，通过破坏海藻糖酶基因或解除葡萄糖阻遏并构建二倍体获得稳定菌株。在葡萄糖-半乳糖混合培养基中，AY-51024M因MIG1敲除而无延滞期，总发酵时间比野生型缩短51%（56小时对114小时）。在51 g/L乳糖培养基中，AY-51024M比生长速率达0.067 h⁻¹，72小时内耗尽乳糖并产乙醇23.4 g/L，为理论转化率的87.1%。在浓缩乳清粉溶液（约150 g/L初始乳糖）中，AY-51024M经120小时几乎耗尽乳糖（残余1.1 g/L），产乙醇63.3 g/L，产率0.53 g/L/h。相反，AY-51024A仅消耗63.7%乳糖。此外，AY-51024A在20%乙醇冲击下存活菌落数为野生型的5倍，胁迫耐受性增强。结果表明解除葡萄糖阻遏是构建高效乳糖利用酿酒酵母的有效策略，AY-51024M具备应用于乳清生物乙醇生产的潜力。
创新点
1）利用ATH1/NTH1基因座整合LAC基因，同时破坏海藻糖酶基因，提高海藻糖积累及乙醇/渗透压耐受性；2）利用MIG1基因座整合LAC12基因，解除葡萄糖对半乳糖代谢的阻遏，使葡萄糖和半乳糖可同时利用，加速乳糖消耗；3）构建了二倍体Lac+酿酒酵母，在浓缩乳清粉溶液中高效产乙醇。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae AY-5 | 葡萄糖阻遏/半乳糖代谢调控 | MIG1 | Mig1p | 调控 | 葡萄糖阻遏相关转录因子，在AY-51024M中被破坏以解除阻遏 |
| Saccharomyces cerevisiae AY-5 | 海藻糖代谢 | NTH1 | 中性海藻糖酶 | 催化 | 编码中性海藻糖酶，在AY-51024A和AY-51024M中作为LAC4整合位点被破坏 |
| Saccharomyces cerevisiae AY-5 | 海藻糖代谢 | ATH1 | 酸性海藻糖酶 | 催化 | 编码酸性海藻糖酶，在AY-51024A中作为LAC12整合位点被破坏 |
| Saccharomyces cerevisiae AY-51024A | 乳糖代谢 | LAC4 | β-半乳糖苷酶 | 催化 | 来自Kluyveromyces marxianus，整合于NTH1位点，受PGK1启动子控制 |
| Saccharomyces cerevisiae AY-51024A | 乳糖代谢 | LAC12 | 乳糖通透酶 | 转运 | 来自K. marxianus，整合于ATH1位点，受PGK1启动子控制 |
| Saccharomyces cerevisiae AY-51024M | 乳糖代谢 | LAC4 | β-半乳糖苷酶 | 催化 | 来自K. marxianus，整合于NTH1位点，受PGK1启动子控制 |
| Saccharomyces cerevisiae AY-51024M | 乳糖代谢 | LAC12 | 乳糖通透酶 | 转运 | 来自K. marxianus，整合于MIG1位点，受PGK1启动子控制 |
关键发现
- 成功构建两株消耗乳糖的酿酒酵母AY-51024A和AY-51024M。在葡萄糖-半乳糖混合培养基中，AY-51024M的总发酵时间比野生型AY-5缩短51%（56 h vs 114 h），且无延滞期
- AY-51024A缩短32%（78 h vs 114 h）。在乳糖培养基（51 g/L乳糖）中，AY-51024M的比生长速率为0.067 h^-1，特异乳糖摄取率为2.50 g lactose g CDW^-1 h^-1，72 h内耗尽乳糖，产乙醇23.4 g/L，为理论转化率的87.1%，乙醇产率0.34 g/L/h
- AY-51024A的比生长速率为0.025 h^-1，特异乳糖摄取率为0.98 g lactose g CDW^-1 h^-1，72 h后残余乳糖17.5 g/L，产乙醇14.3 g/L，为理论转化率的79.3%。在浓缩乳清粉溶液（约150 g/L初始乳糖）中，AY-51024M经120 h几乎耗尽乳糖（残余1.1 g/L），产乙醇63.3 g/L，产率0.53 g/L/h，理论转化率78.4%
- AY-51024A仅消耗63.7%乳糖，产乙醇35.9 g/L，产率0.21 g/L/h，理论转化率70.2%。β-半乳糖苷酶活性在乳糖培养基中AY-51024M为320.00 IU/g yeast（toluene法），AY-51024A为300.52 IU/g yeast。AY-51024A在20%乙醇冲击1 h后存活菌落数为AY-5的5倍，AY-51024A在20% NaCl冲击下耐受性最强。
研究结论
解除葡萄糖阻遏（敲除MIG1）是构建高效乳糖利用酿酒酵母的有效策略。菌株AY-51024M能够在厌氧条件下快速利用乳糖（包括浓缩乳清粉溶液）并高产乙醇，同时因NTH1破坏而提高胁迫耐受性，具有应用于乳清生物乙醇生产的潜力。