Improving ethanol and xylitol fermentation at elevated temperature through substitution of xylose reductase in Kluyveromyces marxianus
- 作者
- Biao Zhang, Lulu Li, Jia Zhang, Xiaolian Gao, Dongmei Wang, Jiong Hong
- 单位
- School of Life Science, University of Science and Technology of China, Hefei, Anhui, China; Hefei National Laboratory for Physical Science at the Microscale, Hefei, Anhui, China; Department of Biology and Biochemistry, University of Houston, Houston, TX, USA
- 杂志
- Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology（2013）
- DOI
- 10.1007/s10295-013-1230-5
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
马克斯克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）在高温下木糖发酵能力弱，由于限氧条件下NADPH偏好型木糖还原酶（XR）导致胞内氧化还原失衡，需要改造辅酶特异性并提高XR表达以促进木糖消耗和发酵。
研究策略
用来自Pichia stipitis的野生型木糖还原酶基因Psxyl1及其突变体N272D、K21A/N272D替换K. marxianus内源Kmxyl1基因，构建重组菌株，并在42℃和45℃下评估其生长、XR活性、木糖消耗及乙醇/木糖醇产量。
核心内容
该研究针对马克斯克斯克鲁维酵母在高温下木糖发酵能力弱、因NADPH偏好型内源木糖还原酶导致氧化还原失衡的问题，用来自Pichia stipitis的野生型Psxyl1及其突变体N272D、K21A/N272D替换内源Kmxyl1基因，构建重组菌株，并在42℃和45℃下评估发酵性能。结果显示，表达PsXR N272D的菌株YZB014在42℃下产3.55 g/L乙醇和11.32 g/L木糖醇，分别比对照提高12.24倍和2.70倍，木糖消耗量提高3.94倍（19.00 g/L），其XR活性以NADPH和NADH为辅因子分别为99和73 mU/mg，显著高于对照。该菌株在45℃和30℃下仍保持较好发酵，在玉米芯半纤维素水解液中也能高效消耗木糖并产醇和木糖醇。而仅改变辅酶偏好但表达不足的K21A/N272D突变体因XR活性极低导致发酵失败。研究表明，高活性与辅酶特异性优化需兼顾，YZB014是高温木糖发酵的优良菌株，适用于木质纤维素底物利用。
创新点
首次将P. stipitis木糖还原酶突变体N272D引入K. marxianus，该突变体对NADPH和NADH均有较高活性，显著提高了高温下木糖发酵性能；揭示了仅改变辅酶偏好（K21A/N272D）但表达不足时无法提升发酵，证明了高活性和辅酶特异性改变必须兼顾。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Kluyveromyces marxianus YHJ010 | 木糖代谢 | Kmxyl1 | KmXR | 催化 | 内源木糖还原酶，仅偏好NADPH，作为对照菌株 |
| Kluyveromyces marxianus YZB001 | 木糖代谢 | ΔKmxyl1 | — | 催化 | 敲除内源Kmxyl1的菌株，用于外源XR替换 |
| Kluyveromyces marxianus YZB013 | 木糖代谢 | Psxyl1 | PsXR | 催化 | 表达P. stipitis野生型木糖还原酶 |
| Kluyveromyces marxianus YZB014 | 木糖代谢 | Psxyl1(N272D) | PsXR N272D | 催化 | 突变体，对NADPH和NADH活性均提高，最佳发酵菌株 |
| Kluyveromyces marxianus YZB015 | 木糖代谢 | Psxyl1(K21A/N272D) | PsXR K21A/N272D | 催化 | 辅因子偏好完全转向NADH，但表达量低导致活性弱 |
| Pichia stipitis | 木糖代谢 | Psxyl1 | PsXR | 催化 | 外源基因来源，其XR和突变体用于替换K. marxianus内源XR |
| Kluyveromyces marxianus | 木糖代谢 | Kmac1 | 肌动蛋白 | 调控 | 作为RT-PCR内参基因，不属于代谢途径但用于表达分析 |
| Kluyveromyces marxianus | 木糖代谢 | GAPDH启动子 | — | 调控 | 用于驱动Psxyl1及其突变体表达的组成型启动子 |
关键发现
- 表达PsXR N272D的菌株YZB014在42℃下产生3.55 g/L乙醇和11.32 g/L木糖醇，分别比对照YHJ010提高12.24倍和2.70倍
- 木糖消耗量比YHJ010提高3.94倍（19.00 g/L vs 4.82 g/L）。YZB014的XR活性以NADPH和NADH为辅因子分别为99和73 mU/mg，比YHJ010（12和5 mU/mg）提高8.54倍和14.32倍
- YZB013（表达野生型PsXR）的活性为82和41 mU/mg，提高7.05和7.98倍。YZB014在30℃下产乙醇3.44 g/L、木糖醇9.57 g/L
- 在45℃下产乙醇2.26 g/L、木糖醇9.10 g/L。在40 g/L木糖时，YZB014消耗33.62 g/L木糖，产23.40 g/L木糖醇和4.51 g/L乙醇。在玉米芯半纤维素水解液（含25.88 g/L木糖、3.67 g/L葡萄糖等）中，YZB014在42℃消耗21.41 g/L木糖及全部葡萄糖和果糖，产12.21 g/L木糖醇和4.09 g/L乙醇。表达K21A/N272D的YZB015因表达量低（RT-PCR相对表达量0.11，而YZB014为1.00，YZB013为0.46）导致XR活性极低（NADH为辅因子时仅8 mU/mg），发酵几乎失败。
研究结论
通过替换木糖还原酶为活性更高且辅酶偏好优化的PsXR N272D，可显著提高K. marxianus在高温（42℃）下的木糖消耗和乙醇/木糖醇产量；仅改变辅酶偏好而表达不足不足以改善发酵。YZB014是高温木糖发酵的优良菌株，可用于玉米芯水解液等木质纤维素底物。