Enhanced expression of genes involved in initial xylose metabolism and the oxidative pentose phosphate pathway in the improved xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae through evolutionary engineering
- 作者
- Jian Zha, Minghua Shen, Menglong Hu, Hao Song, Yingjin Yuan
- 单位
- Key Laboratory of Systems Bioengineering, Tianjin University, Ministry of Education, Tianjin 300072, People's Republic of China; Department of Pharmaceutical Engineering, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, People's Republic of China; School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University, Singapore 637457, Singapore
- 杂志
- Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology（2013）
- DOI
- 10.1007/s10295-013-1350-y
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
重组酿酒酵母利用木糖的发酵效率低，表现为木糖消耗慢、副产物木糖醇产量高、乙醇产量低。本文通过进化工程改良菌株并解析其分子机制。
研究策略
对表达NADP+偏好型木糖醇脱氢酶的重组酿酒酵母SyBE004进行木糖为唯一碳源的反复适应性进化，获得改良菌株SyBE005；利用恒化培养、实时定量RT-PCR和基因组测序比较SyBE004与SyBE005的转录差异和遗传突变。
核心内容
该研究以表达NADP+偏好型木糖醇脱氢酶的重组酿酒酵母SyBE004为出发菌株，通过以木糖为唯一碳源的反复适应性进化获得改良菌株SyBE005，并借助恒化培养、实时定量RT-PCR和基因组测序系统解析了其性能提升的分子机制。进化后菌株的木糖醇产量较亲本降低78.3%，比乙醇生产率提高2.6倍；在20 g/L木糖微氧发酵中，SyBE005于48 h内耗尽全部木糖并产生6.80 g/L乙醇（得率0.33 g/g），而SyBE004仅消耗60%木糖、产乙醇2.50 g/L（得率0.20 g/g）。转录分析显示，XYL1、XYL2、XKS1表达上调1.9–3.9倍，ZWF1和RPE1分别上调63%和68%，PYK1下调26%；酶活测定证实XR总酶活提高11.60倍、XDH提高4.3倍。基因组测序鉴定出240个SNP，其中CYC8（His337Gln）、PHD1（Glu261Gly）及ZWF1（Tyr89Ser）突变被认为与表型相关。结果表明，进化工程通过增强初始木糖代谢基因表达、强化NADPH供给（ZWF1突变与上调）及非氧化磷酸戊糖途径（RPE1）等手段显著提升木糖发酵性能，CYC8和PHD1突变可能参与解除转录抑制，为酿酒酵母木糖利用的进一步改造提供了新靶点。
创新点
1. 将进化工程与转录组/基因组分析相结合，从全局水平揭示木糖发酵性能提高的分子机制；2. 首次对表达NADP+偏好型木糖醇脱氢酶的酿酒酵母进行转录差异研究；3. 发现转录调控因子CYC8和PHD1的突变与木糖代谢基因上调相关，并鉴定ZWF1的新突变（Y89S）。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae SyBE004/SyBE005 | 木糖初始代谢途径（XR-XDH途径） | XYL1 | 木糖还原酶 (XR) | 催化 | 来自Scheffersomyces stipitis，NADPH偏好型 |
| Saccharomyces cerevisiae SyBE004/SyBE005 | 木糖初始代谢途径（XR-XDH途径） | XYL2 | 木糖醇脱氢酶 (XDH) | 催化 | 工程化NADP+偏好型突变体 |
| Saccharomyces cerevisiae SyBE004/SyBE005 | 木糖初始代谢途径 | XKS1 | 木酮糖激酶 | 催化 | 木酮糖磷酸化 |
| Saccharomyces cerevisiae SyBE004/SyBE005 | 氧化磷酸戊糖途径 | ZWF1 | 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 | 催化 | 突变Y89S可能增强NADPH产生 |
| Saccharomyces cerevisiae SyBE004/SyBE005 | 非氧化磷酸戊糖途径 | RPE1 | 核酮糖-5-磷酸差向异构酶 | 催化 | 进化后表达上调68% |
| Saccharomyces cerevisiae SyBE004/SyBE005 | 非氧化磷酸戊糖途径 | TAL1 | 转醛醇酶 | 催化 | 构建SyBE004时强启动子过表达 |
| Saccharomyces cerevisiae SyBE004/SyBE005 | 非氧化磷酸戊糖途径 | TKL1 | 转酮醇酶 | 催化 | 构建SyBE004时强启动子过表达 |
| Saccharomyces cerevisiae SyBE004/SyBE005 | 非氧化磷酸戊糖途径 | RKI1 | 核糖-5-磷酸异构酶 | 催化 | 构建SyBE004时强启动子过表达 |
| Saccharomyces cerevisiae SyBE004/SyBE005 | 碳代谢调控 | CYC8 | 转录共抑制因子 Cyc8 | 调控 | 点突变 His337Gln |
| Saccharomyces cerevisiae SyBE004/SyBE005 | 碳代谢调控 | PHD1 | 转录激活因子 Phd1 | 调控 | 点突变 Glu261Gly |
关键发现
- 进化菌株SyBE005的木糖醇产量较亲本SyBE004降低78.3%，比乙醇生产率提高2.6倍
- 在20 g/L木糖微氧发酵中，SyBE005在48 h内消耗全部木糖并产生6.80 g/L乙醇（得率0.33 g/g），而SyBE004仅消耗60%木糖，产生2.50 g/L乙醇（得率0.20 g/g）
- 木糖醇得率从0.42 g/g降至0.12 g/g（降低约71%）。在50 g/L木糖发酵中，SyBE005的木糖消耗率比SyBE004高42%，乙醇得率为0.33 g/g（SyBE004为0.25 g/g）。在葡萄糖/木糖混合发酵中，SyBE005利用97%木糖，乙醇得率0.37 g/g，木糖醇得率0.23 g/g。恒化培养中，SyBE005的特异木糖消耗率和特异乙醇生产率分别为SyBE004的2.2倍和2.6倍，特异木糖醇生产率仅为SyBE004的21.7%，生物量浓度高59.8%。酶活测定显示SyBE005的XR总酶活提高11.60倍，XDH总酶活提高4.3倍。转录分析显示XYL1、XYL2、XKS1表达上调1.9-3.9倍，ZWF1和RPE1分别上调63%和68%，PYK1下调26%。基因组测序鉴定出240个SNP，其中CYC8（His337Gln）、PHD1（Glu261Gly）和ZWF1（Tyr89Ser）的突变可能与表型相关。
研究结论
进化工程显著提高了重组酿酒酵母的木糖发酵性能，其机制涉及初始木糖代谢基因（XYL1、XYL2、XKS1）的高表达、NADPH供给增强（ZWF1突变与表达上调）、非氧化磷酸戊糖途径RPE1上调以及呼吸和糖异生途径的激活。CYC8和PHD1突变可能参与解除木糖代谢基因的转录抑制。该研究为木糖发酵酿酒酵母的进一步代谢工程提供了新靶点。