Efficient secretion of inulin fructotransferase in Pichia pastoris using the formaldehyde dehydrogenase 1 promoter
- 作者
- Rongrong Zhan, Wanmeng Mu, Bo Jiang, Liuming Zhou, Tao Zhang
- 杂志
- Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology（2014）
- DOI
- 10.1007/s10295-014-1516-2
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
实现IFTase在毕赤酵母中的高效分泌表达，探索以PFLD1启动子替代PAOX1启动子的可行性，为DFA III工业化生产提供基础。
研究策略
构建携带IFTase基因和PFLD1启动子的重组毕赤酵母，优化碳源（甲醇、甘油、葡萄糖）和氮源（甲胺盐酸盐、硫酸铵），并在3L发酵罐中采用四种补料分批策略实现高细胞密度表达。
核心内容
该研究在毕赤酵母GS115中实现了菊粉果糖转移酶（IFTase）的高效分泌表达，探索以甲醛脱氢酶1启动子（PFLD1）替代常用的醇氧化酶启动子（PAOX1）的可行性。研究者构建了携带ift基因和PFLD1启动子的重组菌株，系统比较了甲醇、甘油、葡萄糖三种碳源以及甲胺盐酸盐、硫酸铵两种氮源的诱导效果，并在3L发酵罐中通过四种补料分批策略实现高细胞密度表达。结果表明，以甲醇和甲胺盐酸盐共诱导时IFTase活性最高达62.72 U/mL，是野生型菌株的3.2倍；以葡萄糖为碳源时活性为51.68 U/mL，以甘油为碳源时为30.13 U/mL，证明该系统支持无甲醇培养。发酵罐中的活性较摇瓶提升4.6至9.9倍，最高细胞密度OD600达168.1（干重22.9 g/L）。该研究首次证实PFLD1启动子可有效驱动IFTase分泌表达，其中甲醇/甲胺共诱导策略效果最佳，同时为DFA III的工业化生产提供了无需甲醇的可行方案。
创新点
['首次在毕赤酵母中利用PFLD1启动子分泌表达IFTase', '实现甲醇/甲胺盐酸盐协同诱导的高效表达', '证明甘油和葡萄糖可作为无甲醇培养策略的碳源']
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris GS115 | 甲醇代谢/氮源调控 | PFLD1（FLD1启动子） | — | 调控 | 用于驱动IFTase基因表达的启动子 |
| Pichia pastoris GS115 | 菊粉降解 | ift | IFTase（inulin fructotransferase） | 催化 | 来自Arthrobacter aurescens SK 8.001，催化菊粉生成DFA III |
关键发现
- 最大IFTase活性62.72 U/mL（甲醇和甲胺盐酸盐共诱导），是野生型菌株的3.2倍
- 葡萄糖为碳源时活性51.68 U/mL，甘油为碳源时30.13 U/mL，硫酸铵+甲醇为53.38 U/mL
- 摇瓶最大活性约6.33-7.22 U/mL
- 发酵罐活性比摇瓶高4.6-9.9倍
- 甘油和葡萄糖适宜浓度分别为0.5-1.5%（v/v）和1-1.5%（w/v）
- 甲胺盐酸盐浓度1.5%-3%（w/v）对诱导有益但高浓度抑制生长
- 细胞密度OD600最高达168.1（对应干重22.9 g/L）。
研究结论
PFLD1启动子能有效驱动IFTase在毕赤酵母中的分泌表达，其中甲醇/甲胺盐酸盐共诱导策略效果最佳，且该系统支持无甲醇培养，为DFA III工业生成提供了可行方案。