Enhanced acetate ester production of Chinese liquor yeast by overexpressing ATF1 through precise and seamless insertion of PGK1 promoter
- 作者
- Jian Dong, Haiyan Xu, Libin Zhao, Yefu Chen, Cuiying Zhang, Xuewu Guo, Xiaoyue Hou, Didi Chen, Chenxi Zhang, Dongguang Xiao
- 杂志
- Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology（2014）
- DOI
- 10.1007/s10295-014-1522-4
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何在不引入任何外源DNA序列的前提下，通过精确无缝插入强启动子PGK1p过表达ATF1基因，以提高中国白酒酵母的乙酸酯产量并保持遗传安全性
研究策略
采用融合PCR与两步整合相结合的策略：先构建携带ATF1上游序列、PGK1p和ATF1下游序列的融合片段并克隆至整合载体，线性化后转化ura3缺陷型工业酵母，通过URA3筛选和5-FOA反向筛选实现启动子的无缝插入，最终恢复URA3基因，获得无外源DNA残留的自克隆工程菌
核心内容
针对中国白酒工业酵母中乙酸酯产量不足的问题，研究开发了一种不引入任何外源DNA的精确无缝启动子插入方法。该策略通过融合PCR构建携带ATF1基因上游序列、强启动子PGK1p及下游序列的融合片段，克隆至整合载体后转化ura3缺陷型菌株，再经5-FOA反向筛选实现启动子的无缝替换，最终恢复URA3基因获得遗传安全的自克隆工程菌CLX14-P。结果显示，工程菌的ATF1 mRNA水平较亲本提高40倍，醇乙酰转移酶酶活提高5倍；乙酸乙酯产量从25.04 mg/L提升至78.76 mg/L（3.1倍），总酯产量从53.94 mg/L提高到114.93 mg/L（2倍），而CO2失重、乙醇浓度及残糖等发酵特性与亲本基本一致。该工作证实了通过无缝启动子插入强化ATF1表达能有效提升白酒酵母的酯类合成能力，且所得菌株不含异源DNA、发酵性能稳定，为工业菌株风味改良提供了可行的自克隆策略，具备商业化应用潜力。
创新点
提出一种结合融合PCR和两步整合的精确无缝启动子插入方法，无需限制性酶切连接；插入启动子后不保留任何异源DNA序列，属于自克隆菌株；保留了目标基因上游天然序列，最大程度避免对相邻基因表达的影响
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母 CLX14（中国白酒工业酵母） | 乙酸酯合成 | ATF1 | Atf1p | 催化 | 醇乙酰转移酶，催化乙酸酯合成，是本研究的主要过表达靶标 |
| 酿酒酵母 CLX14-P（工程菌） | 乙酸酯合成 | ATF1 | Atf1p | 催化 | 通过无缝插入PGK1p实现ATF1过表达，酶活和乙酸酯产量显著提高 |
| 酿酒酵母 CLX14 | 基因表达调控 | PGK1 | — | 调控 | 其启动子PGK1p被无缝插入ATF1上游用于增强表达，属于调控元件 |
| 酿酒酵母 CLX14-u3（ura3缺陷型） | 嘧啶代谢 | URA3 | 乳清苷酸脱羧酶 | 催化 | 作为两步整合的选择标记，用于筛选整合子和5-FOA反向筛选，最终恢复为原养型 |
关键发现
- 工程菌CLX14-P的ATF1 mRNA水平较亲本提高40倍，AATase酶活提高5倍
- 乙酸乙酯产量从25.04 mg/l提高到78.76 mg/l（3.1倍）
- 总酯产量从53.94 mg/l提高到114.93 mg/l（2倍）
- 发酵特性与亲本相似（CO2失重20 g，乙醇15% v/v，残糖29 g/l）
研究结论
成功构建了高产乙酸酯且遗传安全的工业酿酒酵母菌株CLX14-P，通过PGK1p无缝插入过表达ATF1显著增强了乙酸酯合成，菌株保持稳定发酵性能且无外源DNA残留，为白酒工业风味的改良和商业化应用奠定了基础